加味芎藭汤含药血清对ICAM-1、VCAM-1和PS含量的影响

袁 征,徐文娟,彭 伟

血管内皮细胞的损伤及功能紊乱与高血压、冠心病及糖尿病等多种疾病的发生密切相关,其中,细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管细胞间黏附分子-1(vascular cellular adhesionmolecule-1,VCAM-1)和颗粒膜蛋白(PS)的含量变化与血管内皮细胞损伤密切相关[1]。本实验以AngⅡ建立血管内皮细胞损伤模型,以加味芎藭汤含药血清为干预因素,观察含药血清对血管内皮细胞分泌的ICAM-1、VCAM-1和PS含量的影响,为加味芎藭汤治疗与血管内皮损伤相关联的疾病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验药品 加味芎藭汤中之银杏叶、当归、酒大黄、川芎均由山东中医药大学附属医院中药房提供,并经山东中医药大学中药学院中药鉴定教研室鉴定为正品。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)由美国Sigma公司提供;卡托普利由山东潍坊制药厂提供,批号:10910005。

1.2 试剂 DMEM干粉培养、胎牛血清(FCS)、过氧化氢(H2O2)、胰蛋白酶,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(M TT),美国Gibco公司产品;二甲基亚砜(DMSO),天津市福辰化学试剂厂;酶联免疫吸附法ICAM-1与VCAM-1和PS测定试剂盒购自美国BPB生物医学有限公司。

1.3 仪器 水套式二氧化碳孵箱,美国Nuaire公司产品;倒置相差显微镜,全自动生化分析仪:AU1000型,日本OLYMPUS公司产品;超净工作台,苏州净化设备公司产品;酶联免疫检测仪,华东电子管厂产品;LX808动力学定量绘图酶标仪,美国宝特原装进口产品。实验用细胞人脐静脉内皮细胞系(ECV-304),购自山东省医学科学院,由美国组织培养库ATTCCCRI-1998引进)。

1.4 含药血清制备 雄性Wiatar大鼠10只,加味芎藭汤按13.3 g/(kg◦d)灌胃给药,连续7 d,于末次给药2 h后,麻醉,取血,无菌分离血清,经56℃、30 min灭活后,配置含药血清培养液备用。

1.5 细胞培养与分组 采用胰蛋白酶消化传代血管内皮细胞,倒置相差显微镜下观察细胞形态,采用4～6代细胞用于实验。随机分组。①DMSO溶媒对照组;②AngⅡ组:AngⅡ2×10-7mol/L;③卡托普利组:AngⅡ2×10-7mol/L+160 mg/L卡托普利;④30%含药血清组:AngⅡ2×10-7mol/L+30%含药血清;⑤20%含药血清组:AngⅡ2×10-7mol/L+20%含药血清;⑥10%含药血清组:AngⅡ2×10-7mol/L+10%含药血清;⑦5%含药血清组:AngⅡ2×10-7mol/L+5%含药血清,继续培养24 h。

1.6 细胞增殖活性测定 将4×104/mL细胞悬液接种于96孔培养板,每孔200 μ L(8×103/孔)细胞悬液,同上分组和培养后,每组设4个复孔,继续培养44 h,换含1%血清培养基继续培养24 h后,弃培养液,每孔加入 MT T 20 μL(5 mg/mL),温育4 h,每孔加入 150 μ L DMSO,混匀后于酶标仪波长490 nm处测吸光度(OD),以OD值来表示细胞增殖活性。

1.7 细胞培养上清液 ICAM-1、VCAM-1和PS含量 采用酶联免疫法(Elisa法)测定 ICAM-1、VCAM-1和 PS含量。绘制校正曲线,以标准品浓度作纵坐标,OD值作横坐标。

2 结 果

2.1 血管内皮细胞形态观察 低倍光镜下观察可见,内皮细胞贴壁生长。细胞呈单层扁平或多角形细胞。细胞核为圆形或椭圆形,核内染色质稀疏空亮,可见一两个核仁。细胞生长融合形成单层,呈典型的鹅卵石或铺路石镶嵌状排列生长。传代12 h后,可见细胞生长增殖呈小簇状生长,24 h后,细胞生长形成细胞群细胞团块中间较密,周边细胞多为长梭形并游离向外生长。

2.2 对细胞增殖的影响 与DMSO溶媒组相比,AngⅡ各浓度组人血管内皮细胞增殖显著升高。选取2×10-7mol/L AngⅡ体外干预人血管内皮细胞以引起细胞增殖。与AngⅡ组比较,200μ g/mL～400 μ g/mL各剂量卡托普利组细胞增殖活度均显著减少(P＜0.05)。与AngⅡ组比较,5%～20%各剂量含药血清组的细胞增殖活度均显著减少(P＜0.05)。含药血清在5%～20%剂量范围内能抑制AngⅡ对内皮细胞的增殖效应,但作用强度有别。30%含药血清组呈色极弱,镜下观察细胞数量较少,大量细胞死亡,表明30%含药血清对ECV304细胞增殖有极强的抑制作用,推测具有一定的细胞毒性效果。1%含药血清组呈色较强,接近正常细胞组,镜下观察细胞生长状况良好,表明在该剂量对ECV304增殖无明显的抑制作用。详见表1。

表1 各组OD值的比较(±s)

表1 各组OD值的比较(±s)

组别 n 剂量 OD值DMSO溶媒组 4 ― 0.64±0.12 AngⅡ模型组 4 1×10-7mol/L 0.83±0.231)4 2×10-7mol/L 1.02±0.071)4 10×10-7mol/L 0.60±0.20卡托普利组 4 50 μ g/mL 0.66±0.052)4 200 μ g/mL 0.59±0.022)4 400 μ g/mL 0.48±0.132)4 1 000 μ g/mL 0.16±0.022)含药血清组 4 1% 0.61±0.05 4 5% 0.55±0.10 4 10% 0.34±0.023)4 20% 0.25±0.023)4 30% 0.13±0.043)与DMSO溶媒组比较,1)P＜0.05;与AngⅡ模型组比较,2)P＜0.05;与卡托普利组比较,3)P＜0.05

2.3 对细胞培养上清液ICAM-1、VCAM-1和PS含量的影响

各组与DMSO组比较内皮细胞中的PS含量均明显降低(P＜0.05)。模型组PS含量明显降低,加入各组含药血清后PS均有明显升高,其中含药血清的药效比较为:卡托普利组＞10%组＞5%组＞20%组＞30%组。详见表2。

模型组VCAM-1含量明显升高(P＜0.05),加入各组含药血清后VCAM-1均有明显降低(P＜0.05),其中含药血清的药效比较为:20%组＞卡托普利组＞10%组＞5%组＞30%组。详见表2。

模型组ICAM-1含量明显上升(P＜0.05),加入各组含药血清后ICAM-1均有明显降低(P＜0.05),其中含药血清的药效比较为:卡托普利组＞10%组＞20%组＞30%组＞5%组。详见表2。

表2 各组ICAM-1、VCAM-1、PS表达的比较(±s)ng/mL

表2 各组ICAM-1、VCAM-1、PS表达的比较(±s)ng/mL

组别 n ICAM-1 VCAM-1 PS DMSO溶媒组 6 38.80±13.28 26.17±3.63 13.19±7.08 AngⅡ模型组 6 53.11±5.88 52.58±38.432) 7.00±1.222)卡托普利组 6 33.00±1.991)2) 28.46±3.90 9.45±0.792)30%含药血清组 6 46.94±15.67 48.35±21.252) 6.52±1.832)20%含药血清组 6 35.77±5.941) 24.69±2.18 7.40±1.782)10%含药血清组 6 35.35±4.901) 29.40±3.98 8.01±0.912)5%含药血清组 6 48.78±10.37 38.92±6.54 7.91±1.392)与AngⅡ模型组比较,1)P＜0.05;与DMSO溶媒组比较,2)P＜0.05

3 讨 论

目前认识的黏附分子主要有ICAM-1、VCAM-1、E-选择素和P-选择素。黏附分子参与内皮细胞、白细胞和血小板之间以及血管内皮基质之间的相互黏附与作用,导致炎症反应[1]。ICAM-1与VCAM-1的浓度升高被认为是内皮细胞活化和炎症的标志[2]。

ICAM-1和VCAM-1同属于免疫球蛋白超家族成员。ICAM-1广泛地表达在各种血源性和非血源性细胞的表面,如白细胞、血管内皮细胞等,通过与其配体β整合素-白细胞功能相关抗原1(LFA-1)和Mac-1(CD11b/CD18)的结合,主要介导多形核白细胞、淋巴细胞和单核细胞的黏附,促进炎症的发生和发展[3]。Min等[4]通过实验证实VEGF能使白细胞与内皮细胞黏附增加,并使内皮细胞表面ICAM-1与VCAM-1的表达增加。

PS是选择素家族的重要成员,又名膜颗粒蛋白。P-选择素主要分布于血小板表面和内皮细胞Weibel-Palade小体中,在内皮细胞活化时,P-选择素迅速表达在细胞膜上,介导白细胞和内皮细胞的起始黏附,并增加血管内皮细胞表面黏附分子的亲和力[5]。因此,PS在细胞表面的表达是内皮细胞和血小板活化的标志,它参与介导血小板的活化及内皮细胞与中性粒细胞和单核细胞的黏附,在炎症、血栓形成中起重要作用。PS与其配体结合后起信号传递作用,活化靶细胞或改变其功能状态,从而介导白细胞-内皮细胞,参与血管局部的炎症反应,进一步加重内皮细胞损伤[6]。

ICAM-1和VCAM-1表达于受刺激迅速分泌PS的活化内皮细胞表面,通过与其相应配体结合介导白细胞与血管壁接触,并使白细胞在激活的内皮细胞表面紧密黏附,阻塞了毛细血管微循环,进一步加重内皮细胞损伤。Kacimi等[7]发现炎症因子白介素(IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)可以增加内皮细胞、白细胞表面ICAM-1与VCAM-1的表达,促进二者的黏附,加重内皮细胞损伤。

加味芎藭汤由银杏叶、当归、酒大黄、川芎组成,具有活血祛瘀、行气通脉之功,是治疗急性脑缺血有效复方。抑制急性脑缺血大鼠模型脑皮质局部和血液中白细胞的ICAM-1表达和白细胞的聚集,发挥改善急性脑缺血的作用。但否能够抑制白细胞和内皮细胞的黏附与聚集尚不清楚。本实验选择AngⅡ建立血管内皮细胞损伤为研究对象,以加味芎藭汤含药血清干预手段,观察到加味芎藭汤含药血清降低内皮细胞分泌的ICAM-1、VCAM-1,升高内皮细胞分泌的PS,从而调节血管内皮的黏附功能。

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