白僵菌Bb08-12菌株生物学研究及其对美国白蛾的致病性

刘宝生, 谷希树, 许静杨, 胡 霞, 孙淑琴, 白义川

(天津市植物保护研究所,天津 300112)

白僵菌Bb08-12菌株生物学研究及其对美国白蛾的致病性

刘宝生, 谷希树, 许静杨, 胡 霞, 孙淑琴, 白义川

(天津市植物保护研究所,天津 300112)

对采自美国白蛾僵虫的虫生真菌Bb08-12菌株进行了生物学研究及致病性测定。根据该菌株的形态特征将其初步鉴定为球孢白僵菌(Beauveriabassiana)。室内测定结果表明:该菌株在26℃恒温、高湿度下对1龄中期美国白蛾幼虫具有较强的致病力。107孢子/mL剂量饲毒处理幼虫72～120 h,幼虫死亡率可达25.47%～79.32%,120 h的LC50为1.169×106孢子/mL。该菌株在不同培养基上菌落形态差异明显。沙氏培养基上产孢量最高,10 d产孢量可达到5.59×108孢子/cm2,极显著高于PSA、查彼培养基和5%麸皮-蔗糖固体培养基上的产孢量。24 h光照和24 h黑暗两处理间的菌落生长量差异不明显,而在培养的最初48 h,24 h黑暗处理可显著促进分生孢子萌发。

美国白蛾; 白僵菌生物学特性; 致病性测定

美国白蛾(Hyphantria cuneaDrury)原产于北美,属鳞翅目灯蛾科(Arctiidae),是国际检疫性对象。在北纬19°～55°广大地区均有分布。主要为害阔叶树种,严重时食光叶片导致整株树木枯死[1],是我国林业病虫害防控的重要对象。从20世纪80年代已经开始对美国白蛾生物防治技术基础与应用展开研究并取得了重大成果[2]。然而利用白僵菌防治美国白蛾的基础与应用技术研究才刚刚起步,研究报道的文献不多。2008年12月陆秀君等人报道了对美国白蛾高毒白僵菌菌株的筛选及与化学药剂相容性研究结果[3]。本文作者对采自天津市美国白蛾幼虫的白僵菌Bb08-12菌株进行了形态初步鉴定、生物学特性与致病性测定。现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 菌源

供试菌株为笔者2008年10月采自天津市农科院北区白蜡林地美国白蛾罹病虫尸。

1.2 培养基

试验用培养基种类[4-5]如下。

沙氏(SDAY)培养基:蛋白胨10 g,葡萄糖40 g,酵母膏2 g,琼脂粉20 g,蒸馏水1 000 mL,调pH为5.6。

查彼(Czapek)培养基:硝酸钠2.00 g,磷酸二氢钾1.00 g,氯化钾0.50 g,硫酸镁0.50 g,硫酸亚铁0.01 g,蔗糖 30.00 g,琼脂粉 17～20 g,蒸馏水1 000 mL。

5%麸皮-蔗糖固体培养基:50 g麸皮放入1 000 mL水中煮30 min,过滤,补足水量至1 000 mL,然后加入20 g蔗糖、蛋白胨2 g、磷酸二氢钾0.2 g、硫酸镁0.2 g、琼脂粉18 g,加热至培养基成分完全溶解后再补充一次水至1 000 mL,过滤、分装至三角瓶,高压灭菌备用。

5%麸皮-蔗糖液体培养基:为不含琼脂粉的5%麸皮-蔗糖固体培养基配方,制作过程与5%麸皮-蔗糖固体培养基相同。

1.3 菌种分离、纯化

用无菌水冲洗下僵虫的白色菌粉,配制成菌悬液并充分摇荡,逐渐稀释,涂布于沙氏平板灭菌培养基上,26℃下恒温培养。培养3 d左右,挑取单个微小白色菌落,接入灭菌的试管斜面沙氏培养基上继续培养,培养菌落占到斜面的2/3时置于低温保存备用。

1.4 形态学鉴定

采用载玻片直接培养法[6]。培养3 d左右,可观察到成熟的分生孢子及分生孢子梗,进行显微测量与照相。

1.5 不同培养基上菌落形态观察及菌落生长量测定

菌落形态观察:用20 d菌龄的白僵菌菌粉制备悬浮液;用接种针蘸取悬浮液点接于90 mm平板培养基上,置于有人工光照的培养箱内26℃恒温培养10 d,观察菌落形态。

生长量测定:用20 d白僵菌菌粉制备悬浮液。用接种针蘸取悬浮液点接于90 mm平板培养基上,置于培养箱内全暗26℃恒温培养,接菌后第8天采用十字交叉法各测量一次菌落直径,每处理重复4次,进行方差分析。

产孢量测定按文献[7]法,计算公式:1 cm2菌落孢子数量=(平均每个小格孢子数量×4×106×稀释倍数)/(3.14×r2×n),r为菌落半径(cm),n为菌落的数量(块)。

1.6 不同光照条件下白僵菌菌落生长量及孢子萌发的测定

菌落生长量:测定全暗和全光条件下白僵菌Bb08-12菌落的生长速度。用20 d菌龄的白僵菌菌粉制备悬浮液;用接种针蘸取悬浮液点接于沙氏平板培养基中置于26℃恒温培养箱内培养,第4天开始测量直径,每个处理8次重复取平均值,并进行方差分析。

孢子萌发测定:用10 d菌龄的白僵菌菌粉适量放入等量的 5%麸皮-蔗糖液体培养基中,振荡15 min,置于26℃恒温培养箱内,全光、全暗(用纸包裹严密)处理。测定培养24、48、72 h的孢子萌发率,其方法为:在16×40的视野下镜检孢子数量和萌发的孢子数量。萌发标准:芽管长度超过或等于孢子的最小半径时判定为萌发。各处理的孢子悬浮液镜检前摇匀,每处理随机测5个视野,每个视野的孢子数量以40～50个左右为宜,密度大时可在载玻片上加水稀释。取5次重复平均值,并进行方差分析。

1.7 白僵菌Bb08-12菌株对美国白蛾幼虫致病性测定

2009年5月21日采集田间白蜡树叶片上的美国白蛾1龄中期幼虫,体长5～6 mm。每处理3次重复,每重复20头左右,待幼虫取食20 h左右稳定后再饲喂带毒叶片。

白僵菌Bb08-12菌株孢子悬浮液的制备:用沙氏培养基上培养20 d的分生孢子粉加0.05%吐温-80 配成 107、106、105、104、103孢子/mL 5 个浓度梯度,0.05%吐温-80清水为空白对照。

带毒叶片饲喂处理:把新鲜白蜡叶片洗净,静置30～40 min,风干叶面水分,在不同剂量白僵菌悬浮液中浸湿后阴干叶面水分,即成带毒叶片。用不同剂量带毒叶片饲喂备好的美国白蛾幼虫,每皿20头左右。培养皿内底层垫3～4层面巾纸,并滴加适量清水(以不能控出水为宜),使培养皿内保持高湿状态,纸上铺带毒白蜡叶片,接入已稳定取食的美国白蛾幼虫,培养皿盖与底之间加面巾纸密封防幼虫逃走,然后置于26℃恒温培养箱内;每天调查幼虫死亡情况,逐日调查5 d,适时更换带毒叶片。

统计各处理和空白对照的逐日幼虫死亡率,对各处理死亡率进行方差分析。

应用DPS软件计算毒力回归方程及 LC50和相关系数[3]。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定结果

从美国白蛾幼虫僵尸分离、纯化得到编号为Bb08-12的白僵菌菌株,直接镜检可见:分生孢子梗单生,呈瓶状;孢子梗的瓶体形状从基部显著膨大到细长瓶形不等(见图1,图2)。分生孢子生在“之”字形小梗上(见图2),多数为圆球形,少数卵圆形,无色 、单胞,直径大小为 1.61～3.18 μ m,平均直径2.23 μ m。由此形态特征,根据文献[7-8,10]初步鉴定为真菌门、半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、白僵菌属、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。

2.2 不同培养基上菌落形态观察及菌落生长量、产孢量的测定

2.2.1 不同培养基上形成的菌落形态

白僵菌Bb08-12菌株在不同培养基上形成的菌落形态不同,其各自特点见表1。

表1 白僵菌Bb08-12菌株在不同培养基上的菌落形态

2.2.2 白僵菌Bb08-12菌株在不同培养基上生长量及产孢量

从表2结果看出:该菌株菌落生长量在4种培养基上有显著和极显著差异。菌落在PSA培养基上生长极显著快于沙氏培养基上,显著快于5%麸皮-蔗糖培养基,但与5%麸皮-蔗糖和查彼培养基相比无极显著差异;在查彼(Czapek)培养基和5%麸皮-蔗糖固体培养基上菌落生长量差异不显著。

产孢量测定结果表明,在沙氏培养基上该菌株产孢量极显著高于其他3个培养基,而这3个培养基之间的产孢量没有极显著差异。其次,5%麸皮-蔗糖固体培养基的产孢量显著高于查彼(Czapek),但与PSA培养基的产孢量相比无显著差异;PSA培养基和查彼的产孢量无显著差异。

表2 白僵菌Bb08-12在不同固体培养基培养8 d菌落生长量及10 d产孢量

2.3 不同光照条件下Bb08-12菌株菌落生长量及孢子萌发率

表3结果表明:不同光照条件对白僵菌菌落生长没有显著影响。在培养的最初24、48 h,全黑暗条件下白僵菌分生孢子萌发率(分别为47.10%,83.36%)显著高于全光条件下相应处理(26.01%,61.46%);培养至72 h,全光和全黑暗条件下分生孢子萌发率不再有显著差异。由此表明,在最初培养48 h内,全黑暗较全光条件可显著促进白僵菌分生孢子的萌发。

表3 不同光照条件下白僵菌Bb08-12菌株菌落生长量和分生孢子萌发率1)

2.4 白僵菌Bb08-12菌株对美国白蛾幼虫的致病性

从表4结果看出,白僵菌对美国白蛾幼虫的致病死亡率随孢子悬浮液中孢子含量和持续时间而增加。饲毒处理后的72～120 h,幼虫死亡率显著提高。在 26℃恒温、皿内高湿度下,球孢白僵菌Bb08-12菌株在107孢子/mL剂量下,对1龄中期美国白蛾幼虫120 h的毒力回归方程、LC50和相关系数R分别为y=0.516 7x+1.865 1、1.169×106孢子/mL和0.947 3。

表4 白僵菌Bb08-12菌株对美国白蛾幼虫致病性测定结果1)

3 讨论

本文对白僵菌Bb08-12菌株进行了形态学鉴定,球孢白僵菌仅为初步结果。后续研究中将采用核酸序列分析进行分子鉴定。

林华峰等人[5]研究证明,湿度是白僵菌孢子萌发和侵染致病的主要制约因子。在温度达10℃以上,相对湿度达95%时白僵菌对松毛虫的侵染致病效应更为显著。因此,本研究致病性测定中,采用1.7方法使皿内小环境在26℃恒温下维持高湿状态,因条件所限未能测定相对湿度数值。

沙氏培养基是目前保存和培养白僵菌最常用的培养基[6],本研究结果也证明该培养基有利于白僵菌产孢,此结果与李会平研究结果[8]不同,是否与所用白僵菌菌株有关,有待研究。此外,本研究发现,在最初培养的48 h内,黑暗处理的分生孢子萌发率显著高于光照处理的萌发率;随培养时间延长,黑暗处理与光照处理的萌发率差异不再显著。这与李会平研究结果是一致的,进一步证明了黑暗处理能够促进白僵菌分生孢子的萌发[9],为白僵菌生产中培养液体菌种、优化发酵条件提供了依据。

[1]刘代文,李红,段学慧.天津地区美国白蛾的生活习性及生物防治[J].天津农业科学,2005,11(1):40-42.

[2]张彦龙,武三安,郭文霞,等.中国美国白蛾生物防治研究进展[J].河北林果研究,2008,23(1):70-77.

[3]陆秀君,李瑞军,董立新,等.美国白蛾高毒白僵菌菌株筛选与高效氯氰菊酯的相容性[J].植物保护学报,2008,35(6):575-576.

[4]方中达.植病研究方法[M].北京:农业出版社,1998.

[5]林华峰,樊美珍,李增智,等.不同温湿度下白僵菌对松毛虫的侵染致病效应[J].应用生态学报,1998,9(2):195-200.

[6]陈声明,张立钦.微生物学研究技术[M].北京:科学出版社,2006.

[7]幸兴球.白僵菌的调查和鉴定[J].昆虫知识,1976,13(3):183-174.

[8]路国兵,王更先,韩景瑞,等.白僵菌菌株的分离鉴定及生物学特性研究[J].中国蚕业,2007,28(2):13-15,32.

[9]李会平.桑天牛幼虫高致病性白僵菌菌株筛选及其致病机理研究[D].保定:河北农业大学,2007.

[10]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海:上海科学技术出版社,1979.

Biological characteristics and pathogenicity of Beauveria bassiana Bb08-12 to Hyphantria cunea larvae

Liu Baosheng, Gu Xishu, Xu Jingyang, Hu Xia, Sun Shuqin,Bai Yichuan
(Tianjin Institute of Plant Protection,Tianjin300112,China)

Biological characteristics and pathogenicity of the entomogenous fungi Bb08-12,isolated fromHyphantria cunealarvae,toH.cuneawere investigated in this study.The strain Bb08-12 was primarily identified asBeauveria bassianaaccording to its morphology.The results showed that the strain Bb08-12 had stronger pathogenicity toH.cuneaat higher humidity and constant temperature(26℃)in the laboratory.WhenH.cunealarvae were fed with leaves containing1×107spores/mL,the 25.47%-79.32%larvae were killed after 72-120 h.The LC50was 1.169×106spores/mL at 120 h.The colony forms ofB.bassianaBb08-12 were remarkably different on different culture media.The number of conidia on SDAY culture medium was the highest,reaching to 5.59×108spores/cm2in 10 days,which was significantly greater than that on PSA,Czapek and 5%bran-sucrose culture media.The growth rates of colonies were not remarkably different between 24 h-light and 24 h-darkness.Conidia germination was significantly improved in 24 h-darkness in the initial 48 h.

Hyphantria cunea; biological characteristic ofBeauveria bassiana; pathogenicity determination

S 476.1

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2011.04.032

2010-07-02

2010-09-28

天津农科院院长基金(09004)

联系方式 E-mail:13207529650@163.com