甘蓝型油菜硫苷含量性状的SSR连锁标记

肖 钢，邬贤梦，张振乾，宋志荣，康国章，官春云*

(1 湖南农业大学油料作物研究所，长沙 410128；2 湖南省农业技术推广总站，长沙 410005；3 河南农业大学国家小麦工程技术研究中心，郑州 450002)

甘蓝型油菜(Brassica napusL)是中国广泛栽培的一种重要油料作物。 油菜籽中硫苷含量是衡量其品质性状的重要指标。籽粒饼粕中的硫苷在芥子酶的作用下，会分裂产生异硫氰酸脂、恶唑烷硫酮及腈等有毒物质，限制了油菜饼粕资源的利用[1,2]。油菜植株内的硫苷及其水解产物对增强油菜抗性具有十分重要的作用[3,4]，特别是在防御昆虫侵犯和食植昆虫的寄主定位，以及抵御细菌和真菌等方面发挥了重要的作用[5～7]。简单序列重复(Simple Sequence Repeat，SSR)是由1～6 bp形成的重复单元组成[8]。SSR标记一般表现为共显性遗传，广泛分布于基因组的编码区与非编码区，由于其检测方法简单快捷，重复性好，因而被广泛应用于遗传连锁图谱构建、基因定位、遗传多样性分析和标记辅助选择育种等。波兰、加拿大、法国等国家的植物育种和遗传工作者在20世纪70年代相继开展了硫苷性状的遗传研究[9]。目前，国内外采用分子标记技术对油菜硫苷性状进行研究的报道较少。本研究以硫苷含量差异较大而其它农艺性状和品质性状相近的967H、967L油菜品系为试验材料，对亲本、F1、F2植株进行SSR标记分析，寻找与硫苷含量性状连锁的SSR标记，分析其对硫苷含量的贡献率，旨在为低硫苷性状基因的进一步定位、克隆以及合理利用硫苷性状提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试油菜品系为967H、967L，由湖南农业大学油料作物研究所提供。967H、967L是从品种湘农油571中分离出的高硫苷和低硫苷品系，并经过连续6代自交后得到，除硫苷性状差异较大外，其它主要农艺性状和品质性状相似，性状稳定，亲缘关系相近。967H硫苷含量为107.48 μmol/g，967L硫苷含量为34.40 μmol/g。58对SSR引物序列来源于网址http://www.ukcrop.net；15对SSR引物采用EMBL基因数据库中的Primer5软件设计；另外20对引物选自Tonguc[10]的研究报告，上述引物均由北京博奥生物有限公司和上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 群体构建

田间试验在湖南农业大学油菜试验基地进行。2005年9月27日播种，行距40 cm，株距18 cm；2006年3～4月进行正反杂交，5月获得F1代种子，9月28日种植正反交F1代各100株，选择亲本、F1代植株各10株进行花期套袋自交；2007年5月获得F2代种子，9月分别种植亲本、F1代材料各4行，F2代20行，每行10株。继续对亲本进行杂交，对F1、F2进行套袋自交；2008年5月获得亲本、F1、F2、F3等世代种子。

1.2.2 油菜基因组DNA的提取及基因池的构建

F2群体在营养生长阶段，每个单株取嫩叶提取基因组DNA。用于分离群体分组分析的基因池参照Michelmore的BSA方法构建[11]，等量取20个高硫苷亲本单株DNA混合建立高硫苷池，等量取20个低硫苷亲本单株DNA混合建立低硫苷池。

1.2.3 SSR标记分析

PCR 体系为 10 μL，其中10×Buffer 1.0 μL，20 mmol/L Mg2+0.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.3 μL，10 μmol/L SSR 引物各 0.5 μL，5 U/μLTaq酶 0.1 μL，模板 DNA 1 μL (50 ng)，ddH2O 6.1 μL。PCR 扩增程序：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，47℃退火30 s，72℃ 延伸50 s，35个循环；72℃后延伸2 min，4 ℃下保存。扩增在 TGadient 96 PCR扩增仪(德国Biometra) 上进行。PCR扩增产物电泳和银染参照Tixier等[12]的方法。PCR产物用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，70 W恒功率电泳1.5 h后银染检测，记录带型。

用93对SSR引物筛选两个亲本967 H、967 L以及高硫苷池和低硫苷池间的多态性标记。对高硫苷池和低硫苷池间产生的稳定多态性的标记，用F2群体验证其与油菜硫苷性状基因的连锁关系。

1.2.4 数据统计分析

根据SSR标记的分析结果，将各单株系和亲本相应位点的带型进行比较，与亲本967H相同带型的标记记为A，与亲本967L相同带型的标记记为B，双亲的杂合带型记为H。用DPS统计软件对F2群体的带型进行统计分析。

1.2.5 硫甙含量的测定

硫甙含量的测定采用刘恒烈等[13]的内源酶法进行。

2 结果与分析

2.1 SSR引物的筛选

利用93对SSR引物，对高硫苷亲本967H和低硫苷亲本967L进行PCR扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶进行检测。部分引物扩增出的带较弱。有18对引物不能扩增出任何带型，占引物总数的14.40%。有 8对引物能够在高硫苷亲本和低硫苷亲本之间扩增出稳定清晰的差异带，占引物总数的6.40%。

用8对能够在双亲间扩增出差异带的SSR引物对高、低硫苷基因池进行进一步的筛选，筛选出1对在2池间稳定表现多态性的SSR引物CB10364(图1)。

图1 引物CB10364在高、低硫苷基因池间的PCR扩增产物电泳图Fig. 1 PCR analysis of SSR primer CB10364 in high and low glucosinolate DNA bulks

2.2 SSR标记的 F2群体检测及硫苷性状连锁关系分析

用SSR引物CB10364对F2群体的180个单株进行扩增(图2)，F2群体PCR扩增结果共有3种带型，即高硫苷亲本带型、低硫苷亲本带型和杂合带型。统计各带型的植株数，分析硫苷含量，并进行单因素方差分析，结果表明：具有A带型的F2植株的种子平均硫苷含量(96.28 μmol/g)极显著高于H带型(78.27 μmol/g)，具有H带型的F2植株的种子平均硫苷含量极显著高于B带型(64.36 μmol/g)。

图2 引物CB10364在双亲、F1及部分F2群体中SSR扩增结果Fig.2 PCR analysis of SSR primer CB10364 in parents, F1 and F2 group

对 CB10364标记的连锁相关性和对低硫苷性状的贡献率进行分析(表1)，发现标记CB10364与低硫苷性状的连锁相关性达极显著水平(F=46.32，p＜0.001)，单标记检测到的 QTL对该群体硫苷含量的贡献率为34.36%。

表1 SSR标记CB10364在F3代中的硫苷含量方差分析Table 1 Variance analysis of SSR marker CB10364 associated with glucosinolate content traits in F3 population of 967H and 967L

3 结论与讨论

本研究从 F2分离群体中选取数量相等的高硫苷单株和低硫苷单株，产生两个混合DNA样品池，在高硫苷基因池、低硫苷基因池中找到了 1个差异明显的SSR引物CB10364。该引物标记稳定、重复性好，为共显性。通过对F2群体进行筛选验证，该引物产生的标记CB10364与硫苷含量性状相连锁，对油菜低硫苷性状的贡献率为34.36%。

菜籽中硫苷的降解产物对动物有害，极大地限制了油菜籽蛋白的利用。油菜中硫苷性状是受多基因控制的数量性状，有研究表明[14]至少受3～6对基因控制，遗传比较复杂。并且栽培技术和环境因素等对植株籽粒硫苷含量有较大影响，据国外研究[15]报道，施肥等栽培措施也可以使硫苷含量相差8 μmol/g以上，因此，采用传统的方法研究油菜硫苷含量的遗传十分困难。而采用分子标记对控制硫苷合成的基因进行定位对研究硫苷的遗传带来极大便利。

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