丰富环境干预对短暂性全脑缺血大鼠学习记忆能力的影响

刘海燕， 蔺 勇， 张 扬， 程永杰

随着社会环境因素和饮食结构的改变，人类脑血管病的发病率和致残率日益增加，其中缺血性脑血管病占脑血管病的80% ～85%［1］，严重地影响着人们的身体健康与生活质量。因此，寻求各种促进脑损伤后功能恢复的有利因素是目前研究的重点。

康复训练已被认定是治疗脑血管病的有效方法之一，其机制是基于脑的可塑性研究，即损伤后的脑组织在多因素的干预下其脑细胞功能得以恢复。以往的研究发现，大鼠对外界环境的认识依赖于视觉、触觉、嗅觉、味觉、听觉、平衡感觉等多种感觉刺激的信息输入，中枢神经系统对这些传入信号进行分析、整合、调整其结构以适应外界环境的变化。目前丰富康复训练对学习记忆功能影响的研究鲜有报道。

因此，本研究通过观察包含多感官刺激的丰富环境模型对短暂性全脑缺血大鼠学习记忆能力的影响，为临床早期积极的环境疗法治疗脑缺血提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

健康雄性清洁级Wistar大鼠，3～4月龄，体重280±20g，由吉林大学实验动物中心提供。

1.1.2 实验仪器

脑立体定位仪，SDQ-30双极射频电凝器，Morris水迷宫自动监控仪，CE-0120型牙科钻。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的制备与分组

所有大鼠随机分为缺血组和假手术组。采用四血管阻断法(4-VO)制备大鼠短暂性全脑缺血再灌注模型［2］。手术前晚大鼠禁食，自由进水。大鼠经10%水合氯醛(3.0～3.5ml/kg)腹腔麻醉后，背面颈正中切口，暴露双侧第一颈椎横突翼小孔，用直径0.5mm的电凝针插入双侧翼小孔，烧灼双侧动脉，造成永久性闭塞。然后腹面颈正中切口，钝性分离双侧颈总动脉，穿线备用，缝合伤口。24h后在动物清醒状态下，用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉，即为缺血开始。大鼠首先出现短暂惊厥，瞳孔散大，眼球呈灰白色，翻正反射消失，脑电图呈一直线。夹闭12min后松开动脉夹，恢复再灌注。整个手术过程中保持动物肛温为37.0±0.5℃。缺血过程中翻正反射未消失或缺血时出现痉挛的大鼠淘汰。假手术组仅暴露4条血管，不夹闭双侧颈总动脉，其余步骤同上。术后手术部位施以适量青霉素抗感染，然后缝合，常规饲养观察。

将术后出现体重明显减轻，探索行为减少，反应迟钝或激惹等情况的大鼠淘汰。各组随机补充大鼠，列为本实验研究对象。缺血组随机分为丰富环境组(Ischemia+Enriched，IE)和标准环境组(Ischemia+Standard，IS)，假手术组亦随机分为丰富环境组(Sham+Enriched，SE)和标准环境组(Sham+Standard，SS)，每组动物8 只。

1.2.2 干预方法

参照Puurunen等［3］方法设计不同环境。于术后第3 d开始干预，IE组和SE组每个笼内5～8只大鼠。此丰富环境为70cm×50cm×82cm的金属有机玻璃，笼内放置不同颜色、形状及气味的物体，包括线链、秋千、积木、塑料管隧道、玻璃球、高低杠等“玩具”，以及有刺激性气味的柠檬、薄荷棉球等。并播放轻音乐，以明暗彩光照射，每天持续1h。该笼每周更换1次，清洁后用新形状、颜色、材料的物品替换，重摆物品的位置，总干预时间为14d。IS组和SS组则每个笼内1～2只大鼠，饲养于30cm×20cm×15cm的不透明标准笼内，不设有任何物体，也不给予上述任何刺激。所有大鼠置于室温下饲养，自由饮水进食。各组以12h为周期进行明暗交替，所有行为测试均在暗周期进行。

1.2.3 大鼠学习记忆能力测试

改良的 Morris水迷宫［4］为一直径 125cm，高50cm的圆池，池壁标有东、西、南、北4个入水点，将水池分为4个象限。将直径8cm，高30cm的圆形透明平台，随机放置于圆池某一象限内固定位置。加水至水深32cm，使平台顶低于液面2cm。将全脂奶粉放于水中混匀，使池水浑浊。加热器维持水温在22℃左右。训练期间迷宫周围参照物保持不变。

干预14d(即缺血28d)开始，各组大鼠开始进行Morris水迷宫实验，训练动物熟悉测试的环境。次日开始正式训练，实验分为两部分:①定位航行实验:用于测试大鼠学习和记忆的获取能力。每天上、下午各1轮，每轮训练4次，每只大鼠每次训练60s，两次训练之间间隔30s，历时4d。训练时随机选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入水中。观察记录动物60s触到平台的时间(逃避潜伏期)以及游泳路线的长度。②空间探索实验:用于测试大鼠对空间位置记忆的保持能力。在5d下午撤除平台，大鼠于原平台对侧象限入水，摄像机拍摄大鼠游泳轨迹，记录其60s内寻找平台的路线图。

1.3 统计学处理

2 结果

缺血后28d开始，我们采用Morris水迷宫观察了各组大鼠的空间学习记忆能力。此时距离全脑缺血发生已近5w，各组动物均无明显神经缺陷症状;同时，训练中它们的游泳速度也不存在显著性差异，因此可以排除运动功能障碍本身对空间认知能力的影响。经过4d的认知训练后我们发现，各组大鼠寻找平台的逃避潜伏期，经由路程均逐渐缩短，这充分表明大鼠可以通过周围环境中的空间线索形成对平台位置的记忆。如表图所示，在测试前3d，与IE组和假手术组相比，IS组动物找到平台的逃避潜伏期延长(见表1)，经由路线增加(见表2)，但最终完成测试任务。IE组和假手术组之间比较，上述改变趋势基本一致，缺乏统计学上的显著性(P＞0.05)。以上结果提示，脑缺血后丰富环境干预可以提高其功能的自发性恢复。

表1 大鼠Morris水迷宫训练过程中平均逃避潜伏期 ± s，s)

表1 大鼠Morris水迷宫训练过程中平均逃避潜伏期 ± s，s)

与IE组和假手术组比较*P＜0.05

IE IS SE SS 36.08 ±2.7542.89 ±4.47*30.23 ±2.2535.66 ±2.5911.94 ±2.4818.11 ±2.7310.53 ±2.3111.14 ±2.117.77 ±1.668.56 ±1.786.97 ±1.539.01 ±1.895.71 ±1.286.46 ±1.444.98 ±1.237.24 ±1.56

表2 大鼠Morris水迷宫训练过程中平均游泳路线长度 ± s，cm)

表2 大鼠Morris水迷宫训练过程中平均游泳路线长度 ± s，cm)

与IE组和假手术组比较*P＜0.05

IE IS SE SS 1980.11 ±176.76*2480.56 ±198.112000.43 ±177.222001.21 ±177.771002.65 ±129.111234.01 ±131.551020.34 ±130.21900.87 ±128.97517.23 ±101.23520.11 ±101.41518.36 ±100.24516.44 ±99.51497.36 ±99.11500.11 ±100.36495.75 ±99.54490.86 ±98.69

3 讨论

由于海马在近期记忆的形成中起到关键性作用，缺血后的动物虽然远期记忆不受影响，但却会表现出对近期事件的顺行性及逆行性遗忘;同时也很难形成新的关于语言或空间的记忆［5］。为了观察短暂性全脑缺血对大鼠学习记忆能力的影响，我们在缺血发生后的第5周测试了各组动物的空间记忆能力，结果发现，虽然缺血组动物在潜伏期、游泳路线等指标方面的表现较比假手术组差，但这些差别却都不显著，表明历时12 min的短暂缺血尚不足以造成大鼠空间学习记忆能力的明显下降。这与文献报道的结果相一致［4］。

不同环境刺激，会对脑的形态和功能产生不同的影响。本实验显示，经过丰富环境干预后，大鼠学习记忆能力得到加强，几乎恢复到正常水平，而标准环境刺激的大鼠学习记忆能力有所减退，说明不同环境刺激对短暂性全脑缺血大鼠学习记忆能力的影响也不同。环境的丰富相对于标准环境而言，体现在空间、内部设置和成员组成上，由此提供不同的刺激，包括多感官、运动和社交刺激。标准环境的生活空间狭小、单调，各种感官刺激和活动非常有限，群体成员少，社交机会遭到剥夺。相反，丰富环境生活空间大，内置物体丰富而新奇，群体成员多，除了能够提供充分的多感官、运动和社交刺激外，还能提供训练学习的机会。学习记忆作为脑的高级活动之一，其实质就是复杂的信息获取、传递与整合的过程。实验中我们观察到，在测试前3d，IS组动物较IE组和假手术组找到平台的逃避潜伏期延长，经由路线增加。由此可见，各组大鼠在学习记忆能力上的差别可能正与其所处不同环境发出信息的质和量不同有关。丰富环境干预可以改善脑缺血大鼠的学习记忆能力。

［1］ 粟秀初，孟锦立.第16届世界神经科学大会中有关缺血性中风的某些诊疗新观点和措施简介［J］.中风与神经疾病杂志，1998，15(2):125－127.

［2］ Pulsinelli WA，Brierley JB.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat［J］.Stroke，1979，10(3):267 －272.

［3］ Puurunen K，Sivenius J.Influence of enriched environment on spatial learning following cerebral insult［J］.Rev Neurosci，2002，13(4):347－364.

［4］ Wiard RP，Dickerson MC，Beek O，et al.Neuroprotective properties of the novel antiepileptic lamotrigine in a gerbil model of global cerebral ischemia［J］.Stroke，1995，26(3):466 －472.

［5］ Squire LR，Zola SM.Ischemic brain damage and memory impairment:a commentary［J］.Hippocampus，1996，6(5):546 － 552.