眼针对大鼠脑缺血再灌注损伤72h后脑皮质BDNF表达的影响*

王 哲，高 原，马贤德，赵金茹，井 欢，关洪全，王德山

(辽宁中医药大学基础医学院，沈阳 110032)

眼针对大鼠脑缺血再灌注损伤72h后脑皮质BDNF表达的影响*

王 哲，高 原，马贤德，赵金茹，井 欢，关洪全，王德山△

(辽宁中医药大学基础医学院，沈阳 110032)

目的:观察眼针对脑缺血再灌注损伤大鼠脑皮质脑源性神经营养因子(BDNF)表达的影响。方法:线栓法复制脑缺血再灌注损伤大鼠模型，随机分为正常组、假手术组、模型组、眼针组。于再灌注72h后进行大鼠神经功能评分，采用RQ-PCR、免疫组化法、western blot法检测缺血脑皮质BDNFmRNA及蛋白的表达。结果:与模型组比较，眼针组大鼠神经功能评分下降，脑皮质BDNF mRNA的表达和蛋白的表达上升(P＜0.01)。结论:眼针能提高脑缺血再灌注损伤大鼠脑皮质BDNF表达水平。

缺血再灌注;脑源性神经营养因子;眼针;脑皮质

随着溶栓及介入治疗的开展，脑梗死患者部分脑组织重新获得血液，减轻了脑组织损伤，但与此同时也大大增加了脑缺血再灌注损伤的危险。脑缺血损伤后脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)表达增高，一定程度上可延缓缺血后神经元损伤。大量实验证实［1］，BDNF对脑缺血再灌注具有保护作用，并能促进缺血后损伤神经元的存活、修复和再生。眼针疗法是彭静山教授根据中医学基本理论结合长期的临床实践所创立的一种微针疗法。眼针对于急、慢性脑血管疾病等具有显著的疗效，但是其作用机制至今尚不清楚。本研究采用改良的线拴法制备大鼠脑缺血再灌注损伤的动物模型，以刺针眼穴肝区、上焦区、下焦区、肾区各穴后，观察眼针对大鼠脑皮质BDNF表达的影响，旨在探讨眼针对缺血后神经元损伤的保护机制，为临床眼针治疗缺血性脑血管疾病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

健康SPF级 SD大鼠64只，雌雄不拘，体质量280g±20g，由北京维通利华实验动物中心提供(许可证号SCXK(京)2007-0001)。适应性喂养1周，自由饮水，摄取标准颗粒饲料，室内温度22℃，相对湿度45%。按随机数字法将大鼠分为对照组、假手术组、模型组、眼针组4组，每组16只。

1.2 模型制备与评价

模型组及眼针组采用改良的线栓法复制大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型，模型制作参照文献［2］。模型成功标准:大鼠于缺血2h后进行再灌注，再灌注后进行神经功能缺损评分，参照ZeaLonga 5分制评分标准:0分为无症状;1分为不能完全伸展对侧前爪;2分为向对侧转圈;3分为向对侧倾倒;4分为不能自发行走，意识丧失。评分为1～3分者纳入实验组，未达标准者排除。假手术组术式同模型、眼针组，区别在于钓鱼线插入深度为0.5cm～1cm，其他同手术组。正常组未处理。

1.3 眼针取穴及刺法

眼针组:采用13mm毫针，于大鼠眶周2mm处针刺，定位参照人体取穴方法［3］，取肝区、上焦区、下焦区、肾区针刺见图1。针刺手法:从眼眶边缘1mm部位平刺，左眼按照顺时针方向(右侧按逆时针方向)，从该穴区起始定位线向终止定位线进针，进行平刺操作，刺入真皮达到皮下组织，进针3mm到终止定位线为止。留针20min，留针10min时用刮柄进行刮针1次，刮针5下。治疗时机:眼针组于脑缺血再灌注即刻及取材前30min(再灌注后2.5h)分别进行眼针治疗，中间每间隔12h针刺1次，共7次。正常组、假手术组和模型组无其他处理。大鼠眼针取穴具体部位见图1。

图1 大鼠眼针取穴示意图

1.4 试剂及实验用药

实时定量PCR试剂盒购自TaKaRa大连宝生物，BDNF引物由北京华大基因公司合成，亲和纯化兔抗鼠BDNF多克隆抗体、即用型SABC免疫组化染色试剂盒及DAB染色试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.5 指标测定

1.5.1 脑皮质 BDNF蛋白表达(免疫组化SABC法) 于缺血再灌注损伤72h对大鼠给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，开胸暴露心脏，将灌注针头从心尖部插入升主动脉，待右心耳膨起后剪开右心耳，依次迅速灌注0.9%生理盐水200ml，4%多聚甲醛200ml，迅速取脑，在视交叉平面后约5mm～10mm处将脑冠状切面切开，留取中间部分，置于4%多聚甲醛固定液中固定，常规脱水、石蜡包埋。将包埋的蜡块做5μm切片，免疫组化按试剂盒说明书操作。BDNF以细胞膜或细胞浆出现清晰棕褐色颗粒为阳性。根据大鼠脑缺血半暗带的定位方法［4］，使用BI2000医学图像分析系统对采集的图像测定阳性反应物的灰度，每例动物随机取3～4张切片，且各组所选部位相同(额顶叶皮质)。

1.5.2 脑皮质BDNF蛋白表达(Western blot法) 于缺血再灌注损伤72h对各组大鼠给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉后断头取出脑组织，每组8只去掉小脑，沿两侧大脑半球连接处将大脑半球切开，剥离出病变侧梗死灶周围皮质分成两部分，一部分做蛋白表达(另一部分做PCR)，按脑组织净重:裂解液=1∶10的比例，加入相应体积的裂解液，PH值为7.5，将样品剪碎后匀浆、离心、上清即为总蛋白。兔抗鼠 BDNF一抗(1∶500);O-dianidine，βnaphthyl acid phosphate显色，扫描仪扫描 NC膜，分析结果。

1.5.3 脑皮质BDNF mRNA的表达 采用RQ-PCR方法:BDNF上游引物:5'ATGGGTTACA CGAAGGA 3';BDNF下游引物:5'GCCCGAA CATACGATT3'。β-actin为内参，其上下游引物分别为:5'CGT GCGTGACATTAAAGAG 3'，5'TTGC CGATA GTGA TGACCT 3'。所有的产物在 ABI Prism 7500 HT序列检测系统中运行。读取CT值，以管家基因β-actin为内参，以扩增倍数作为比较的依据:△CT=CT目的基因-CTβ-actin，△△CT=△CT实验－△CT对照，扩增倍数=2－△△CT。将所扩增的PCR产物同时进行溶解曲线分析。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 神经功能缺损评分

模型组和眼针组大鼠均出现不同程度的神经功能障碍，如提尾时左侧前肢不能伸直，行走向对侧旋转或倾倒等，而假手术组大鼠无神经功能障碍表现。模型组再灌注损伤72h后神经功能缺失症状明显加重，与造模后即刻神经功能缺损评分无差异。眼针组再灌注损伤72h后与造模后即刻神经功能缺损评分有差异(P＜0.01)。

表1 各组神经缺损评分比较(±s，n=8)

表1 各组神经缺损评分比较(±s，n=8)

注:与造模后即刻比较:△P＜0.01;与模型组比较:＊＊P＜0.01

组别 造模后即刻评分 72h 评分正常组00假 手 术 组 0 0模 型 组 2.63±0.92 2.63±0.74眼 针 组 2.63±0.92 1.63±0.52△＊＊

2.2 各组BDNF蛋白表达的比较

免疫组化方法检测结果显示，正常组和假手术组大鼠右侧额顶叶脑组织均有多量BDNF阳性表达，免疫阳性颗粒主要位于神经元细胞核和细胞质，以胞浆边缘显色较深。表2、图2显示，与正常组和假手术组比较，模型组BDNF的阳性表达显著降低，有显著性差异(P＜0.01)。与模型组比较，眼针组BDNF表达明显升高，有显著性差异(P＜0.01)。

图2 眼针对脑缺血再灌注损伤大鼠脑皮质BDNF蛋白表达的影响(SABC法 ×400)

Western blot方法检测结果显示，取大鼠右侧梗死区半暗带脑皮质检测 BDNF蛋白表达，以β-actin为内参，模型组BDNF蛋白表达下降，与正常组和假手术组比较有显著性差异(P＜0.01)，眼针组BDNF蛋白表达明显强于模型组(P＜0.01)见表2、图3。

表2 各组BDNF蛋白表达的比较(±s，n=8)

表2 各组BDNF蛋白表达的比较(±s，n=8)

注:与模型组比较:＊＊P ＜0.01

组 别 免疫组化BDNF灰度值 Western BDNF 灰度值正 常 组 161.3377±11.8654＊＊ 0.7124±0.0234＊＊假 手 术 组 155.0047±14.3928＊＊ 0.7118±0.0673＊＊模 型 组 122.8066±10.5518 0.3327±0.0343眼 针 组 144.0593±13.2793＊＊ 0.6964±0.0388＊＊

图3 各组BDNF蛋白表达影响

2.3 各组BDNF mRNA表达的比较

实时定量PCR方法检测结果显示，采用实时定量PCR方法检测脑梗死区BDNF mRNA表达的结果如表3所示，本实验选用β-actin作为内参，BDNF基因扩增产物大小为237bp，β-actin基因扩增产物为132bp。模型组 BDNF mRNA表达明显降低，与正常组和假手术组比较均有显著性差异(P＜0.01)，眼针组BDNF mRNA表达升高，与模型组比较有显著差异(P＜0.01)。

表3 各组BDNFmRNA表达的比较(±s，n=8)

表3 各组BDNFmRNA表达的比较(±s，n=8)

注:与模型组比较:＊＊P ＜0.01

组 别 BDNF 相对含量正 常 组 1.03±0.18＊＊假手术组 1.1 ±0.12＊＊模 型 组 0.36±0.05眼 针 组 0.8±0.19＊＊

3 讨论

BDNF由Barde［5］等在1982年从猪脑中首先分离和纯化，属于神经生长因子家族成员，在维持神经元功能及其损伤后再生修复方面发挥着重要作用。体外及体内实验研究均证实，BDNF在神经元存活、神经发生分化和增殖以及学习、记忆等方面扮演着重要的角色［6］。BDNF由神经细胞合成并广泛分布于中枢神经系统，以大脑皮质、海马、纹状体分布最为丰富。本实验结果表明，大鼠脑缺血再灌注后，脑组织受损，机体出现神经功能缺损的症状。正常组大鼠脑皮质有较多量的 BDNF表达，因为 BDNF是惟一不断在中枢神经系统和周围神经组织中表达的神经营养因子。模型组大鼠脑皮质BDNF的表达下调，说明缺血再灌注进一步加重脑组织的损伤。眼针组大鼠脑皮质中BDNF的表达明显上调，促进神经元缺血再灌注损伤后的修复，使大鼠神经功能缺损症状得到一定的缓解。BDNF表达的增加可能通过拮抗兴奋性氨基酸毒性［7］，稳定细胞内 Ca2+浓度;增强 GSH-Px 及 SOD 的表达［8、9］，减少自由基的生成;调节 Bcl、Bax 蛋白的表达［10］，拮抗 caspase 活性［11］等途径参与脑缺血损伤后神经元的保护。

目前，临床上对于脑缺血再灌注损伤疾病的治疗效果并不十分理想，亟待寻求新的治疗途径和方法。眼针疗法是由辽宁中医药大学附属医院著名老中医彭静山教授于20世纪70年代首创，即在眼眶周围针刺以治疗全身疾病的一种微针技术，它是针灸施术的一种特殊针法。根据王肯堂转载华元化云:“……皆悬贯于脑，下连脏腑，通畅血气往来以滋于目”的记载，我们提出“眼络于脑，通调脏腑”的中医理论新假说。缺血性中风病机总属阴阳失调、气血逆乱，病位在心脑，与肝肾密切相关。眼针通过刺激眶周穴区达到疏通经络、行气活血、调整脏腑阴阳的作用。治疗以三焦取穴为主，取上、下焦区以疏通上下肢经络，畅通气血，从而促进肢体功能恢复;配合循经取穴，取肝、肾区平调脏腑阴阳以治本，标本兼顾，故能取得良效。本实验结果显示，通过刺针眼穴肝区、上焦区、下焦区、肾区治疗后可以有效地利用并促进内源性BDNF的表达，通过直接增加缺血性脑损伤大鼠海马组织BDNF蛋白的表达，来实现对脑细胞损伤的保护作用。

［1］Blanquet PR，Mariani J，Fournier B．Identification of a biphasic signaling pathway involved in ischemic resistance of the hippocampal dentate gyrus［J］．Exp Neurol，2006，202(2):357-372．

［2］马贤德，孙宏伟，等．线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型的方法研究［J］．中华中医药学刊，2009，27(6):1200-1201．

［3］彭静山．眼针疗法［M］．沈阳:辽宁科学技术出版社，1990:11．

［4］Love S．Oxidative stress in brain ischemia［J］．Brain Pathol，1999，9(1):119-125．

［5］Barde Y A， EdgarD， Thoenen H． Purification ofanew neurotrophic factor from mammalian brain［J］．J EMBO，1982，(1):549-553．

［6］Marini A M，J iang X，Wu X，et al．Preconditioning and neurotophins:a model for brain adaptation to seizures，ischemia and other stressful stimuli［J］．Amino Acids，2007，32:299-304．

［7］Brandoli C．，Sanna A ，De Bernardi MA ，et al．Brain-derived neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor downregulate NMDA receptor function in cerebellar granule cells［J］．Neurosci，1998，18(19):7953-7961．

［8］Mattson MP，Lovell MA，Furukawa K，et al．Neurotrophic factors attenuate glutamate-induced accumulation of peroxides，elevation of intracellular Ca2+concentration，and neurotoxicity and increase antioxidant enzyme activities in hippocampal neurons［J］．Neurochem，1995，65(4):1740-1751．

［9］Heaton MB，Madorsky I，Paiva M，et al．Influence of ethanol on neonatal cerebellum of BDNF gene-deleted animals:analyses of effectson Purkinje cells， apoptosis related proteins， and endogenous antioxidants［J］．Neurobiol，2002，51(2):160-176．

［10］Schabitz WR，Sommer C ，Zoder W，et al．Intravenous brainderived neurotrophic factor reduces infarct size and counterregulates Bax and Bcl22 expression after temporary focal ischemia［J］．Stroke，2000，31(9):2212-2217．

［11］Han RH，D Costa A，Baka SA，et al．BDNF blocks caspase-3 activation in neonalal hypoxia ischemia［J］．Neurobiol Dis，2000，7(1):38-53．

The Effect of Eye Acupuncture on Brain-deprived Neurotrophic Factor Expression in Rat cerebral cortex with Ischemia-reperfusion injury for 72 hours

WANG Zhe，GAO Yuan，MA Xian-de，ZHAO Jin-ru，JING Huan，GUAN Hong-quan，WANG De-shan△
(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang110032，China)

Objective:To investigate the effects of eye acupuncture on brain-deprived neurotrophic factor(BDNF)expression and study the mechnism of ischemia-reperfusion injury improved．Methods:Rats established by suture method were randomly divided into the control group，the sham operation group，the model group and the eye-acupuncture group．After reperfusion 72h，the neurophysical behaviours were accessed by ZeaLonga neurophysical impairment marks;the expression of ischemic cerebral cortex BDNF mRNA was measured by RT-PCR method;the expression of ischemic cerebral cortex BDNF protein was detected by immunohisto-chemistry and Western blot technology．Results:After reperfusion 72h，compared with the model group，the neurologic impairment marks of the eye-acupuncture group decreased obviously(P＜0．05);The expressions of BDNF mRNA and protein in rat cerebral cortex after the eye acupuncture therapy were obviously decreased(P＜0.01)．Conclusion:The eye acupuncture therapy can increase the expression of BDNF in rat cerebral cortex with ischemia-reperfusion injury，and protect brain by improving the repair of neurons．

ischemia-reperfusion injury;Eye acupuncture;brain-deprived neurotrophic factor;cerebral cortex

R245．32+9

B

1006-3250(2011)09-1007-03

国家重点基础研究发展计划资助项目(2007CB512702);辽宁省教育厅科学技术研究项目(L2010351)

2011-03-08

王 哲(1971-)，女，辽宁海城人，教授，医学博士，从事中医肺脾肾对水液代谢调控机制研究。

△通讯作者:王德山，男，教授，从事中医学肺、脾、肾功能调控机体水液代谢的机制研究，E-mail:wwddss5768@sohu．com。