一例从人体分离的布鲁菌的鉴定

李 翔，李 莉，程均福，李国明，崔步云

2.华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科，武汉430030；

3.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，北京10226

布鲁氏菌病（布病）是由布鲁氏菌（布氏菌）感染机体引起的人兽共患的自然疫源性疾病［1］。湖北省曾于上世纪90年代初对全省职业人群的布病疫情分布进行调查，血清学检测结果显示，荆州、孝感、襄樊和直辖市林区4地有布病感染者［2］；2007年，湖北省枣阳市疾病预防控制中心曾报道1例输入性布鲁氏菌病［3］，但上述均未得到病原学证实。2010年12月我们首次从1例疑似患者脊髓液中分离到1株疑似布鲁氏菌菌株，对该菌株的种、型及生物学特性的研究对我省的布病防治工作具有重要的指导意义。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 实验菌株 从疑似患者体内用需氧培养管，全自动血培养仪分离菌株QTB1001，血平皿分离保存，该菌株在营养琼脂上不生长，菌株由武汉同济医院检验科提供。

1.1.2 参考菌株 布鲁氏菌标准菌株牛种菌544A、羊种菌16 M、猪种菌1330S及羊种M5疫苗株由中国疾病预防中心传染病预防控制所（传染病所）提供。

1.1.3 实验试剂 布氏菌阳性血清；A、M因子血清；R型布氏菌血清；布氏菌噬菌体Tb和BK2；1∶5万（20μg/mL）硫堇、碱性复红染料纸片；硫化氢滤纸片；布氏琼脂（美国BD公司）；TRANS 2x Easy Taq Super Mix（全式金生物技术有限公司）；QIA DNeasyblood＆Tissue kit（Qiagen公司）均由传染病所提供。

1.1.4 扩增引物 以下引物均由上海生工生物工程公司合成

1.1.5 实验仪器 Senso Quest labcycler PCR仪（圣欧国际有限公司，德国）。

1.2 方法

1.2.1 布鲁氏菌属常规种型鉴定 硫化氢产生，硫堇、碱性复红抑菌实验，阳性血清、A、M 和R血清凝集实验，布氏菌噬菌体裂解实验，均参照卫生部疾病预防控制局编著《布鲁氏菌病防治手册》［4］。

1.2.2 模板制备 将实验菌株和M5疫苗株分别接种布氏琼脂平板，于37℃恒温培养箱内孵育48 h，用PBS将细菌从平板上洗下，转移到1.5 m L离心管内，在80℃恒温水浴锅中加热30 min灭活后，用Qiagen公司的QIAgen DNeasy blood ＆tissue kit提取全基因组DNA，置于－20℃冰箱中保存备用。

1.2.3 PCR扩增体系 10μL 2×Easy Taq Super Mix，引物浓度均为20μmol/L，0.2μL B.melitensis，0.2μL IS711，0.2μL omp25－F，0.2μL omp25－R，DNA 模板0.3μL（或加入同体积的M5疫苗株DNA作为阳性对照），无菌水9.3 μL，终体积20μL。PCR扩增程序：94℃变性3 min；94℃30 s、58℃30 s、72℃30 s，扩增35个循环；72℃延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测结果。

2 结 果

2.1 菌落生长时间及形态观察 划线培养48 h后，布氏琼脂培养基上可见直径约1 mm圆形、湿润、半透明的菌落，强光下呈油滴状。涂片革兰染色，镜检为革兰阴性细小球杆菌。

2.2 布鲁氏菌诊断血清凝集 用布氏菌阳性血清（1∶800）与菌株玻片凝集，呈阳性反应；粗糙（R）型布氏菌血清（1∶400）玻片凝集，呈阴性反应；A、M因子血清（1∶200）玻片凝集，均有凝集反应。初步判定为布鲁氏菌，否定粗糙型、犬种和绵羊附睾种布氏菌。

2.3 布鲁氏菌属种型鉴定 用布氏菌的特异噬菌体Tb和BK2对菌株裂解实验，100和104×RTB的Tb均不裂解被检菌株，BK2能产生清晰的噬菌斑。结合2.1和2.2，被检菌QTB1001各项鉴定结果符合羊种布鲁氏菌3生物型。详见表1、图1。

2.4 AMOS－PCR鉴定结果 用布鲁氏菌的特异性属引物和种引物对布鲁氏标准菌株M5疫苗株和被检菌株提取的基因组DNA分别进行AMOSPCR扩增，结果均能扩增出特异性片段；特异性属引物omp25扩增片段大小为490 bp，特异性种引物扩增片段大小为731 bp，说明该菌株为羊种布氏菌，见图2。

表1 布鲁氏菌的种型鉴定结果Tab.1 Species and biovar identification for test strain

3 讨 论

omp25蛋白是布氏菌的外膜结构蛋白，PCRPFLP分析显示，不同种属布鲁氏菌的omp25基因具有高度的同源性，基因序列在布氏菌各种及生物型变种间高度保守。通过对6个种布氏菌标准菌株的omp25基因序列进行分析，仅有12个位点的核苷酸发生改变，同源性在98%以上，氨基酸序列差异不超过5个［5］，因此，omp25基因可用做鉴定布氏菌属。

基于AMOS－PCR鉴定布氏菌属、种具有快速、灵敏的优点，特异性和敏感性均高于细菌分离和血清学诊断方法，应用于国内菌株鉴定。它是Bricker等人在1994年根据布鲁氏菌染色体中的遗传成分IS711种特异性定位引起的多态现象建立，并根据在距IS711不同距离的引物杂交扩增产物大小来进行种型鉴定的PCR检测方法，经过多年的发展，该方法现在已能精确辨认所有已知的布鲁氏菌种［6－7］。

疫苗菌株具有很好的稳定性，而毒力较低。本次实验选用羊种菌M5作为部分实验对照，是一个降低了生物安全风险的尝试，建议有关实验室对相关疫苗株作为参照菌株进一步研究。

通过细菌学和分子生物学多种技术对湖北省首次分离菌株鉴定，证实为羊种3生物型布鲁氏菌。流行病学个案调查显示，患者系随州市大堰坡乡挑水村农民，家中养有山羊和绵羊，并从事屠宰工作，全村近年来并未出现羊群集体疫病现象，但有母羊流产现象，检疫情况不详。家中只有岳母与其一起居住，对其家人流调，没有出现布病相关症状，但血清学检测也呈阳性反应，效价1∶100。患者经治疗痊愈，半年后随访未再发病。由此证实我省已有布病流行，并波及人间。建议在国家增加布病的监测点，规范对疑似布病发热病人尽早采样分离菌株。同时协调做好动物布氏菌分离，开展病原流行病学研究。

［1］徐楠，李娜.布氏杆菌病流行病学及诊治研究进展［J］.中国实用医药，2010，5（20）：246－247.

［2］熊培生，晏慧芳，邓朝晖，等.湖北省职业人群布鲁氏菌病调查［J］.中国地方病学杂志，1993，12（4）：224－226.

［3］龚雪英，史天东.输入性布鲁氏菌病一例报告［J］.公共卫生与预防医学，2007，18（3）：19.

［4］卫生部疾病预防控制局.布鲁氏菌病防治手册［M］.北京：人民卫生出版社，2008：17－29.

［5］胡剑飞，崔步云，关平原，等.布鲁氏菌外膜蛋白的研究进展［J］.疾病监测，2010，25（5）：380－389.

［6］Mayer－Scholl A，Draeger A，Göllner C，et al.Advancement of a multiplex PCR for the differentiation of all currently described Brucella species［J］.J Microbiol Methods，2010，80（1）：112－114.

［7］姜海，崔步云，赵鸿雁，等.AMOS－PCR对布鲁氏菌种型鉴定的应用［J］.中国人兽共患病学报，2009，25（2）：107－109.