基质金属蛋白酶蛋白在百草枯致肺纤维化大鼠肺组织中表达及其意义

杜妍，肖莉

（中国医科大学附属盛京医院急诊科，沈阳 110004）

百草枯（paraquat，PQ）为有机杂环类接触性脱叶剂及除草剂，对人有较强毒性，目前中毒机制尚不明确，无特效治疗方案。基质金属蛋白酶家族（matrix metalloproteinases，MMPs）是一类主要降解细胞外基质成分的蛋白酶，在生理和病理过程中发挥着重要的作用。近年来随着研究的深入，发现MMP3、MMP8与肺纤维化有着密切的联系［1］。研究发现腹腔注射百草枯可致大鼠肺纤维化，此病理过程与人类百草枯致肺纤维化过程极其相似，因此，本实验研究百草枯对肺组织病理改变的影响，进一步研究MMP3、MMP8在百草枯致急性肺损伤及纤维化肺组织中的表达及其意义。

1 材料与方法

1.1 材料

雄性SD大鼠购自中国医科大学附属盛京医院实验动物中心。百草枯（99.99%，货号：856177-1G）购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。MMP3（货号：bs-0413R）、MMP8（货号：bs-1913R）抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 动物模型的建立、分组及标本处理

雄性 SD 大鼠40只，SPF 级，体质量（295±20）g，随机分为模型组（PQ组）和盐水对照组（NS组），每组20只。NS组一次性腹腔注射生理盐水8.5 mL/kg。PQ组一次性腹腔注射百草枯15.0 mg/kg。分别于给药后5 d、28 d处死动物，HE染色观察肺纤维化程度，免疫组化法观察各组动物MMP3、MMP8蛋白表达。

1.3 肺泡炎症、肺纤维化程度判断

肺组织石蜡切片HE染色，在光学显微镜下观察肺组织病理学改变。按照Szapiel等［3］的方法评价肺组织病理变化严重程度，评分标准如下：无肺泡炎或无纤维化且肺组织受累面积为0记为“-”；轻度肺泡炎或纤维化且肺组织受累面积<20%记为“+”；中度肺泡炎或纤维化且肺组织受累面积20%～50%记为“++”；重度肺泡炎或纤维化且肺组织受累面积>50%记为“+++”。

1.4 免疫组化法检测肺组织MMP3、MMP8蛋白表达

肺组织石蜡切片常规脱蜡至水，然后按免疫组化试剂盒说明书进行操作。

1.5 统计学处理

采用SPSS 17.0版统计软件，肺组织HE染色肺泡炎或纤维化程度资料用秩和检验Ridit方法，Ridit法是将按等级分组的资料，通过转换成为一组连续性的计量资料，计算Ridit值（简称R值），属于一种非参数统计方法。肺组织免疫组化法观察MMP3、MMP8蛋白表达资料以±s表示。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织的病理学改变

对照组大鼠肺脏外观大致正常，镜下未见炎性细胞浸润和胶原沉积。模型组大鼠5 d时肺组织外观明显肿胀，镜下示肺泡间隔明显增宽变形，肺泡间隔和肺泡腔内重度炎性细胞浸润，以单核/巨噬细胞为主，大部分形成炎症灶，成纤维细胞增多，病灶内已出现肺泡萎缩。28 d时外观呈苍白色，肿胀已基本消退，体积缩小，弹性更差，硬度增加，表面呈结节样改变并可见条索状凹沟，镜下可见肺泡结构破坏，成纤维细胞大量增生，纤维组织呈条索样瘢痕改变，斑片状分布，但外周肺实质炎症有更进一步的吸收（表 1，图 1）。

表1 各组大鼠肺组织H E染色肺泡炎或纤维化程度（n）Tab.1 HE staining of lung tissue of rats alveo litis orfibrosis（n）

图1 各组大鼠肺组织H E染色的动态变化 ×200Fig.1 The HE staining of lung tissue dynam ics×200

2.2 免疫组化法检测MMP3、MMP8在大鼠肺组织内的分布

MMP3、MMP8在正常组大鼠肺组织内呈弱表达。模型组大鼠5 d时肺组织中MMP3、MMP8的表达增强，到28 d时已基本达到正常水平（表2，图2、3）。

表2 各组大鼠肺组织免疫组化法观察MMP3、MMP8蛋白表达（O D值）Tab.2 Rats ineach group immunohist ochemistry inlung tissue was observed mmP3，M M P8prot ei n expressi on（O D val ue）

图2 各组大鼠肺组织免疫组化法观察MMP3蛋白表达动态变化（200×）Fig.2 Lung tissue of rats ineach group were observed by immunoh is tochem istry MM P3 prote in dynam ics（200×）

图3 各组大鼠肺组织免疫组化法观察MMP8蛋白表达动态变化 ×200Fig.3 Lung tissue of rats in each group were observed by im munoh istochem istry MM P8 protein dynam ics×200

3 讨论

百草枯化学名为 1，1′-二甲基 4，4′-联吡啶阳离子盐，为有机杂环类接触性脱叶剂及除草剂［3］。百草枯对人有较强毒性，由于其中毒致死量小、无特效解毒剂、常规对症治疗效果极差，故死亡率较高，国外报道百草枯中毒病死率40%～50%［4］。重度中毒患者可在短时间内死于多脏器功能衰竭，中度中毒时主要损害肺脏，对人有较强毒性，在对人体的损害中主要表现为肺组织的损伤，PQ经胃肠道吸收入血后通过多胺摄取途径可特异性聚集于肺脏，浓度比血液高6～10倍［5］，患者于染毒后24 h迅速出现肺水肿、肺出血及肺不张等急性肺损伤症状，并进行性发展为急性呼吸窘迫综合征，患者如能度过1周左右的急性期，肺部损伤逐渐加重，发展为不可逆的肺间质纤维化，后期多死于呼吸衰竭［6］。肺纤维化的病理特征是肺泡上皮的损伤和成纤维细胞增殖，目前发病机制尚不清，目前对百草枯中毒机制的研究主要集中在以下几方面：氧自由基损伤、炎性细胞浸润、细胞因子及趋化因子、基因异常表达等方面。

MMPs是一类主要降解细胞外基质成分的蛋白酶，在生理和病理过程中发挥着重要的作用。MMPs是一类高度保守的锌离子依赖内肽酶家族，至少有26种人类MMPs［7］。MMPs可以分为3个结构区域：N端的前肽区，催化区和C端的类血结区。MMPs以无活性形式合成，被激活后才有活性。MMPs主要通过两种途径被激活，其一是N端的前肽区变构或转位，其二是N端的前肽区被酶切。它们被激活后能够降解细胞外基质蛋白，同时也可以降解非细胞外基质成分蛋白，如生长因子、细胞因子、趋化因子、细胞受体、丝氨酸蛋白酶抑制剂和其他蛋白酶，从而调节这些化合物的生物活性。基质金属蛋白酶的这一作用可以预防或引发疾病，如癌症、心血管疾病、自身免疫性疾病、神经退行性疾病和各种结缔组织病［8］。多位学者在PQ致肺纤维化机制研究中发现某些基因表达异常，目前研究最多的是MMP2和MMP9，认为它们是降解肺泡基膜主要成分IV型胶原的主要酶类，对肺组织的重构有不可忽视的作用。与此同时对MMP3、MMP8的研究相对较少。Tomita等［4］对C57Black/6J大鼠鼻内饲入不同剂量PQ，实验结果表明在染毒后的5 d内，肺纤维化尚未形成，但已经有基因表达的改变，其中包括MMP3和MMP8，因此本实验研究 MMP3、MMP8，探讨 MMP3、MMP8与肺纤维化之间的关系。结果提示，肺纤维化的发生与MMP3、MMP8的异常表达直接相关，提示它们可能是PQ致肺纤维化的标志物。

综上所述，MMP3、MMP8蛋白在百草枯诱导肺纤维化大鼠肺组织中的表达增强，后进行性下降至实验终点（染毒后28 d）时基本接近正常，提示MMP3、MMP8可能是PQ致肺纤维化的标志物，对MMP3、MMP8的检验将具有重要的临床意义并进一步指导治疗。但本实验并未深入的研究MMP3、MMP8参与肺纤维化的分子生物学机制，这将是我们下一步实验工作的重点。

［1］Tomita M，Okuyama T，Katsuyama H，et al.Mouse model of paraquatpoisoned lungs and its gene expression profile［J］.Toxicology，2007，231（2-3）：200-209.

［2］陶章，李惠萍.不同剂量博莱霉素致小鼠肺纤维化模型的比较［J］.中国组织工程研究生与临床康复，2009，13（7）：1214-1218.

［3］Serra A，Domingos F，Prat MM.Paraquatintoxication ［J］.Acta Med Port，2003，16（1）：25-32.

［4］Hwang KY，Lee EY，Hong SY.P araquat intoxication in Korea［J］.Arch Environ Herlth，2002，57：162-167.

［5］Shimada H，Hirai K，Simamura E，et al.Paraquat toxicity induced by voltage-dependent anion channel 1 acts as an NADH-dependent oxidoreductase［J］.J Biol Chem，2009，284（42）：28642-28649.

［6］Dinis-Oliveira RJ，Duarte JA，Sanchez-Navarro A，et al.Paraquat poisonings：mechanisms of lung toxicity，clinical features，and treatment［J］.Toxicol，2008，38（1）：13-71.

［7］唐莹.Mmp2、Mmp3与肺癌及肺纤维化的研究进展［J］.实用癌症杂志，2009，24（1）：91-92.

［8］Hadler-Olsen E，Fadnes B.Regulation of matrix metalloproteinase activity in health and disease［J］.FEBS J，2011，278（1）：28-45.