不同强度运动对糖尿病大鼠心肌PAI-1及血清NO、NOS的影响

王仁纲 徐国琴 翁锡全 孟艳 林文弢

广州体育学院运动生化省重点实验室（广州 510500）

糖尿病并发症，尤其是心、脑等的血管病变是导致糖尿病死亡的主要原因，严重威胁患者生活质量及生存年限。据报道，糖尿病患者的全部死亡原因中，约30%为心肌梗死［1-3］。有研究提出，糖尿病患者心脏纤溶酶原激活物抑制剂-1 （PAI-l）升高［4］，引起纤维蛋白降解障碍，纤维蛋白原在血管内皮上堆积而产生血栓，是导致糖尿病心肌病发病的重要因素之一，而一氧化氮（NO）具有抑制PAI-1水平，改善纤溶系统的作用，在心血管疾病发生中有重要意义［5］。目前，运动疗法是安全、简便、有效的糖尿病治疗方式，其有效性已在基础研究和临床应用中得到有力证实［6-8］。但有关心血管纤溶系统的报道多限于运动对血液PAI-1的影响，本研究以高脂高糖膳食并腹腔注射链脲佐菌素（STZ）建立糖尿病大鼠模型，观察不同强度运动后糖尿病大鼠心肌组织PAI-1及血清NO、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、总一氧化氮合酶（T-NOS）的变化，探讨运动对糖尿病大鼠心血管舒张功能及血液凝聚功能的影响，揭示运动防治糖尿病并发心肌病的生物学机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型及分组

SPF级健康6周龄雄性SD大鼠87只，体重190±15 g，购自广东省医学实验动物中心（粤监证字2007A003）。自由饮食，饲养和运动时室温20℃～25℃，空气湿度40%～60%，自然昼夜节律，光线充足。

大鼠适应环境1周后给予高脂饲料喂养，其饲料配方为猪油10%、白糖20%、蛋黄粉5%、胆盐0.2%、维生素0.05%、矿物质0.2%、基础饲料64.55%，原料来自广东省医学实验动物中心并由其加工制作。参照文献［9，10］进行高脂饲料喂养并建立糖尿病大鼠模型，即饲养6周后所有高脂饮食大鼠禁食12小时后称量空腹体重，并按30 mg/kg体重的剂量于左下腹一次性腹腔注射STZ缓冲液（20 mg/m l），所配制STZ溶液30分钟内注射完毕。注射3天后对大鼠进行尿糖定性检测，连续3天目测尿糖结果为+++~++++，第7天测试大鼠尾静脉全血血糖，16.7 mmol/L（300 mg/d1）以上者确定为糖尿病大鼠［11］。结果糖尿病大鼠造模成功81只，成功率为93.1/%。从造模成功的糖尿病大鼠中随机选取43只，分为糖尿病安静对照组（DMC）10只，糖尿病运动1组（DME1）、2组（DME2）和3组（DME3），每组11只。运动各组进行跑台（BCPT-98型）运动，依据Bedford等的推荐［12］分为小、中、大3种强度，即DME1组跑速为10 m/min（相当于30%VO2max强度），DME2组为15 m/min（相当于50%VO2max强度），DME3组为20 m/min（相当于70%VO2max强度），每天1 h，其余时间自由活动，每周5天，持续6周。由于高血糖、运动等原因造成实验中大鼠少量死亡，最终取材时各组样本量为DMC组、DME1组、DME3组每组各10只、DME2组9只。

1.2 样品采集与处理

各组大鼠在第6周末次干预后禁食约12 h，称重，尾部静脉取血（测试血糖）后即刻腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉大鼠，腹主动脉取血，室温静置1 h，3000 r/min离心20 min后分离血清，置-70℃超低温冰箱保存，用于血清指标测试。取心肌组织0.5克用4℃预冷的生理盐水洗净血液，滤纸吸干水份后称重，按1:9比例加入生理盐水置匀浆机上10 000 r/min匀浆10 s×3次，制备10%匀浆，4℃以下2000 r/min离心10 min，取上清液测试心肌PAI-1含量。

1.3 测试指标与方法

血糖（FBG）采用日本京都GT-1640血糖仪测试；糖化血清蛋白（GSP）采用果糖胺法测试，仪器为S22PC分光光度计，试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；采用ELISA测试血清胰岛素（FINS），血清NO、eNOS、T-NOS和心肌组织PAI-1，仪器为RT-2100C型多功能酶标仪，试剂盒由美国ADL公司提供。所有测试步骤严格按试剂盒要求操作；胰岛素抵抗指数（IRI）采用国际通用的Homa Model公式计算［13］：胰岛素抵抗指数（IRI）=（FBG×FINS）÷22.5。

1.4 统计学分析

所有数据均以平均数±标准差表示，用SPSS12.0统计软件进行数据处理，各组之间均数比较采用单因素方差分析。P < 0.05为显著性差异，P < 0.01为非常显著性差异。

2 结果

2.1 各组大鼠FBG、GSP、FINS及IRI比较

由表1可知，6周实验后，与DMC组比较，3个运动组FBG显著下降（P < 0.01）；运动各组GSP出现不同程度下降，其中DME1组和DME2组下降有统计学意义（P < 0.05）；运动各组FINS均升高，仅DME3组升高有统计学意义（P < 0.05），且DME1组、DME2组显著低于DME3组（P <0.05）；DME1 组、DME2 组 IRI显著下降（P < 0.05），而DME3组上升，与DMC组相比无显著差异（P> 0.05），且显著高于DME1、DME2组（P < 0.01，P < 0.05）。

表1 各组大鼠空腹血糖、糖化血清蛋白、胰岛素及胰岛素抵抗指数比较

2.2 各组大鼠NO、eNOS、T-NOS及PAI-1比较

表2显示，6周实验后，与DMC组相比，各运动组大鼠血清NO均显著升高（P < 0.05，P <0.01）；血清 eNOS 均显著升高（P < 0.05，P < 0.01）；DME1组T-NOS显著升高（P < 0.05）；各运动组心肌PAI-1均显著降低（P < 0.05，P < 0.01）。

表2 各组大鼠NO、eNOS、T-NOS、PAI-1比较

3 讨论

3.1 不同强度运动对糖尿病大鼠FBG、GSP、FINS及IRI的影响

控制血糖水平是治疗糖尿病和防治糖尿病并发症的关键［6，14］。本研究结果显示，糖尿病大鼠6周不同强度跑台运动后，空腹血糖和糖化血清蛋白均呈不同程度降低，以中小强度运动效果最明显。说明一定强度的运动能降低糖尿病大鼠血糖，改善高血糖症状，对糖尿病的干预治疗是有效的。同时，DME1和DME2组血FINS有升高趋势但无统计学意义，而IRI显著下降，表明6周低、中强度跑台运动能提高胰岛素敏感性，减轻大鼠胰岛素抵抗程度，其效果与运动强度有关。其机制为规律的有氧运动作为一种高能耗的刺激，可加强机体组织细胞摄取和利用葡萄糖，改善和提高机体组织细胞的胰岛素敏感性。

3.2 不同强度运动对糖尿病大鼠心肌PAI-1含量的影响

PAI-l为单链糖蛋白，其活性增加对组织型纤溶酶激活物（t - PA）和尿激酶型纤溶酶原激活物（u- PA）起抑制作用。糖代谢紊乱时，引起心脏PAI-l升高［4］，使纤溶酶原生成减少，纤维化和血栓形成，导致心肌缺血、缺氧，最终演变为糖尿病心肌病。研究发现，急性运动迅速升高血浆纤溶活性，其作用与运动的剧烈程度和持续时间相关；次极量运动（40%最大运动量持续30 min）可使纤溶活性中度升高。运动增加纤溶活性的机制可能是促进血管内皮释放纤溶酶原活化因子，参与纤溶调节，或通过运动减少腹部脂肪，使脂肪细胞合成的PAI-1减少［15］。此外，不同运动强度对PAI-1的影响结果不同，低强度运动对PAI-1活性影响较小，力竭性运动可使PAI-1活性上升，而中等负荷运动可降低PAI-1活性，有效预防血栓性疾病［16，17］。其机制可能为适当运动可使儿茶酚胺和脑垂体后叶释放PA释放激素（PARH）分泌增多，促使血管内皮细胞合成与释放t-PA，进而抑制PAI-1生成，有效增加血纤溶活性［18，19］。本实验结果显示，糖尿病大鼠6周运动后，各运动组大鼠心肌PAI-1与糖尿病对照组相比均显著下降。这与上述研究结果一致。但由于本实验缺少正常对照组，对不同强度运动降低心肌PAI-1，改善纤溶系统及防治糖尿病并发心肌病的生物学机制还有待探讨。

3.3 不同强度运动对糖尿病大鼠血清NO、eNOS、T-NOS的影响

NO水平在一定程度上反映糖尿病心肌血管损伤的程度，其代谢失常可能是导致糖尿病心肌病的机制之一［20］。NOS是合成NO的关键酶，有3种亚型：神经源型一氧化氮合酶（nNOS）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）。iNOS催化产生的NO发挥较强的自由基效应，而eNOS催化产生的NO为强有力的内源性血管舒张因子，对血管有较强的保护作用，抑制血管平滑肌增殖，减少血小板黏附，抑制脂质过氧化及氧自由基的产生，使细胞免受超氧阴离子损伤［21］。

长期有氧运动不仅增加eNOS活性，也上调eNOS mRNA表达，增加NO合成量，促进内皮依赖性的舒张反应，进而防治心血管疾病［22］。王玉等研究发现，12周有氧运动在改善糖尿病患者心率变异的同时，提高了血浆NO水平［23］。适宜负荷的游泳训练也可提高大鼠心肌与血清eNOS活性，改善心血管系统功能；而长时间过度负荷的游泳训练可使大鼠心肌与血清iNOS活性升高，引起心血管内皮细胞损伤，影响心血管功能［24］。本研究结果显示，糖尿病大鼠6周运动后，运动各组eNOS与DMC组相比显著升高，仅DME1组T-NOS显著升高，这可能与T-NOS是三种NOS的总和，影响因素较多，个体差异大有关，T-NOS不高还间接说明iNOS较低对心肌组织有利。另外，3种强度运动组糖尿病大鼠血清NO均显著升高，这与王玉、孙红梅等的研究［23，24］结果一致，且eNOS和NO的变化有强度依赖性，中等强度运动更有利于提高糖尿病大鼠血清NO水平。

4 总结

6周不同强度有氧运动可降低糖尿病大鼠心肌PAI-1含量，提高血清eNOS活性和NO水平，对糖尿病心肌病起到一定的预防与控制作用。

6周不同强度有氧运动对糖尿病大鼠心肌PAI-1和血清eNOS活性、NO水平的影响有一定的强度依赖性。

［1］Canavy I，Henry M，Morange PE，et al. Geneticpolymorphisms and coronary artery disease in the South of France. Thromb Haemost，2000，83：212-216.

［2］Mattila TK，de Boer A. Influence of intensive versus conventional glucose control on microvascular and macrovascular complications in type 1 and 2 diabetes mellitus. Drugs，2010，70（17）：2229-2245.

［3］Olexa P，Olexova M. Plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1)，ischemic heart disease and diabetes mellitus.Vnitr Lek，2003，49（3）：222-226.

［4］ 王越晖，蔡露. 糖尿病／肥胖相关的炎症，心肌细胞死亡及心肌病 . 中南大学学报（医学版），2006，31（6）：814-818.

［5］ 张成秋，葛志明，杨纯珍，等. 2型糖尿病心血管病变与一氧化氮及一氧化氮合酶的关系. 中国老年学杂志，2006，26（7）：1010-1012.

［6］ 黄飞翔. 糖尿病病人患冠心病心肌代谢临床研究进展.中西医结合心脑血病，2004，2（10）:597-598.

［7］ 高素霞，孟和. 运动缺乏病及其干预措施. 中国临床康复，2005，9（8）：182-183.

［8］ 周多奇，龚莉. 糖尿病运动疗法及其机理. 安庆师范学院学报（自然科学版），2006，12（3）：107-10.

［9］ 翁锡全，徐国琴，林文弢，等. 不同运动强度对糖尿病大鼠血清骨代谢生化指标的影响. 中国运动医学杂志，2009，28（5）：522-525.

［10］Reed MJ，Meszaros K，Entes LJ，et al. A new rat model of type 2 diabetes: the fat-fed，streptozotocin-treated rat. Metabolism，2000，49（11）：1390-1394.

［11］余臣祖，张朝宁. 实验性2型糖尿病动物模型研究进展.医学综述，2006，12（1）：41-42.

［12］Bedford，Toby G，Charles M，et al. Maximum oxygen consumption of rats and its changes w ith various experi-mental procedures. J Appl Physiol，1979，47（6）：1278-1283.

［13］Haffner SM，Gonzaler C，Stern MP，et al. A prospective analysis of the HOMA model. The Mexico City Diabetes Study. Diabetes Care，1996，（109）：1138-1141.

［14］许晓静，李国杰. 糖尿病性心肌病的研究进展. 实用糖尿病杂志，2009，5（5）：3-4.

［15］EI-Sayed MS，Sale C，Jones PG，et al. Blood hemostasis in exercise and training. Med Sci Sports Exerc，2000，32（5）：918-925.

［16］Rocker L，Mockel M，Westfahl KP，et al. In fl uence of maximal ergometric exercise on endothelin concentration in relation to molecularmarkersof the hemostatic system.Thromb Haemost，1996，75（4）：612-916.

［17］杨波，张钧，刘丽荣. 运动对高蛋氨酸饮食大鼠血浆t-PA、PAI含量和t-PA/PAI系统的影响. 中国康复医学杂志，2006，21（9）：804.

［18］刘宇春，沈志祥. 运动、糖尿病、t-PA与PAI-1. 牡丹江医学院学报，2008，29（5）：60-62.

［19］Rastaldo R，Pagliaro P，Cappello S，et al. Nitric oxide and cardiac function. Life Sci，2007，81（10）：779-793.

［20］尹萍，金文敏. 内皮型一氧化氮和酶及其抑制剂与2型糖尿病血管内皮功能. 天津药学，2008，20（2）：66-68.

［21］Anderson TJ. Nitric oxide atherosclerosis and the clinical relevance of endothelial dysfunction. Heart Fail Rew，2003，8：71-86.

［22］田振军，吴潇男. 运动训练对大鼠主动脉一氧化氮合酶及细胞凋亡的影响. 天津体育学院学报，2007，22（1）：6-8.

［23］王玉，任艳，宋晓红. 有氧运动对糖尿病患者心率变异的影响. 中国运动医学杂志，2006，25（4）：404-406.

［24］孙红梅. 不同运动负荷对大鼠心肌与血清一氧化氮及其合酶的影响. 中国运动医学杂志，2008，27（2）：214-215.