灵芝菌丝体液体深层发酵研究进展

赵翾

（仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东 广州 510225）

灵芝菌丝体液体深层发酵研究进展

赵翾

（仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东 广州 510225）

灵芝是我国著名药用真菌，其中的多糖和三萜是有效的抗肿瘤物质，但由于野生灵芝很少，种植灵芝周期长，占地广，受季节影响，难以产业化生产，因而价格昂贵。为了使更多人受惠，利用液体深层培养发酵灵芝菌丝体是目前的重要发展方向。本文将对灵芝菌丝体液体深层发酵进行综述，并作出展望。

灵芝菌丝体；液体深层发酵；发酵工艺

灵芝（Ganoderma lucidum）是我国入药已达二千多年的著名药用真菌，属担子菌纲、多孔菌目、灵芝科、灵芝属。现代医学研究证明它对于慢性支气管炎、冠心病、肝炎、高血脂症、神经衰弱、肿瘤病的辅助治疗、白细胞减少症、硬皮病、皮肌炎等疾病有不同程度的疗效[1-4]，而灵芝中的主要药效成分为灵芝多糖和三萜[2-4]。然而，由于野生灵芝很少，而种植灵芝存在着周期长，占地广，受季节影响等制约条件，难以产业化生产。另外传统的灵芝生产以子实体或孢子入药，灵芝子实体纤维化、木质化程度高，苦味浓，灵芝孢子细胞壁厚，不易被人体利用，不适宜于直接作食品、药品原料[5]。因此以发酵法生产灵芝成为当前大趋势，其中液体深层发酵技术有生产周期短、产率高、生产过程容易控制、产品质量稳定且提取分离容易的特点,而且通过液体深层发酵生产灵芝菌丝体,产品苦味小,营养价值及有效成分不低于子实体甚至有些指标高于子实体,其中菌丝体中的粗多糖及多糖含量均高于子实体，分别为子实体的2.26倍和3.5倍[5]，被广泛用于许多药用真菌的生产，在生产灵芝菌丝体方面也备受瞩目。因此本文对灵芝菌丝体液体深层培养作了综述。

1 灵芝生产菌种选育

灵芝种类繁多，我国有记载的灵芝有103种，其中14种已被人们所利用[6]。品种间的不同均可能引起有效成分在产量表达上的差异，因此适合液体深层发酵的优良灵芝菌株的筛选非常必要。夏志兰等[7]，以8个灵芝菌株为研究对象，比较不同菌株在固体培养基上的菌丝体及液体发酵的菌球萌发菌丝生长速度、液体发酵产物、子实体多糖等指标。结果表明:8个菌株菌丝体生长速度有一定差异，灵芝G9、红芝早萌发且生长速度快，甜芝、紫芝、灵芝G8、血芝其次，灵芝5760、黑芝最慢，其中，血芝次生代谢产物多糖最高。

从自然界分离出的灵芝菌，依靠自身代谢调节系统，趋向于平衡生长和繁殖，生长速度慢，生产能力低，不能满足液体深层发酵对大规模灵芝生产菌种的要求[5]。为此，李刚等[8]，对灵芝菌株进行原生质体紫外诱变育种，成功得到2株多糖含量和产量明显高于原始菌株的诱变株。另外，也可通过原生质体融合的方法，来打破灵芝菌的正常代谢，使之失去自我保守性的调节控制，可快速生长而且可大量积累目标代谢产物（如灵芝多糖、灵芝酸等）[5]。

2 培养基选择

在灵芝发酵生产中，培养基组分的变化会影响灵芝菌丝体活性成分的产生[9]。培养基主要由碳源、氮源、无机盐和生长因子组成，适当的配比和pH对灵芝菌丝体发酵以及多糖的产量有重要影响。

2.1 碳源

真菌菌丝体多利用果糖、葡萄糖等单糖[10]。由于现代社会对清洁生产的关注，越来越多食品企业用食品加工行业的废渣,如废糖蜜、淀粉渣等作为碳源。由于灵芝菌丝体是低糖发酵，糖浓度过高使溶液渗透压过高，菌丝体中的水分会被吸到溶液中去，造成细胞脱水死亡[11]。胡焕荣[11]通过对20批容积为10m3，定容为7.5 m3发酵罐的正常实验发现，总糖不能超过3.5%，特别是还原糖（葡萄糖）的用量不能超过3%。一般选择总糖量在3%左右，还原糖控制在1.5%左右。刘冬等[12]对15种常用碳源作了研究对比，发现单糖碳源以葡萄糖、二糖以蔗糖、多糖以玉米粉等为最适碳源，灵芝菌丝体在液体培养基中的生长速度以在葡萄糖培养基中最快,蔗糖次之,多糖最慢。李平作等研究了产胞外多糖的碳源构成，发现除葡萄糖之外，玉米粉和酒糟等复合碳源也有促进增产的优势[13]。相继研究也证实使用复合碳源对提高发酵灵芝多糖和灵芝酸的产量有利[14-16]。

2.2 氮源

氮源是灵芝菌丝体发酵的重要物质，氮源过少会导致菌丝体生命力较弱，出现菌丝体提前自溶。在灵芝液体深层发酵中一般采用有机氮源，如黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉、水解植物蛋白、蛋白胨、氨基酸、酵母粉、酵母膏、麦麸等。氮源限制或过量对菌丝体生长不利，且限制供应可提高低分子量多糖的含量[17]。培养基总氮浓度通常保持在0.04%～0.1%[18]。无机氮源中以硫酸铵为最适氮源,有机氮源中以黄豆饼粉等为最适氮源，最适碳氮比以在（23.6～31.1）∶1[12]。一般使用复合N源较好。以玉米粉，豆饼粉，麸皮和山药的混合物作为氮源,菌粉得率达到（31.2±1.4）g/L[18]，而使用酵母膏和蛋白胨混合氮源比使用任一单一氮源时的灵芝多糖和灵芝酸产量都有明显增加[19-20]。

2.3 无机盐

从大型真菌生理上讲，钾对糖酵解有促进作用，磷酸盐不足可能会抑制糖代谢，此外，镁离子含量太少会影响碳源的氧化[10]，故灵芝生长需要的无机盐中磷、镁、钾最为重要。实践证明，只要加入磷酸二氢钾0.12%，硫酸镁0.04%，就能达到灵芝菌丝体的生长要求[11]。

2.4 生长因子

灵芝菌丝体生长中需要一定量维生素类物质，特别是VB1，它在灵芝生长过程中不能自己合成，必需从外界补充。实践证明，在培养基中加入VB150 mg/L，能促使菌丝体生长粗壮[11]。

2.5 pH

灵芝菌丝体液体深层培养过程中,培养液的pH对菌丝的生长有较大的影响,灵芝菌丝体生长过程中要求培养最适宜的起始pH为6.0～6.5[21]。当pH低于3.5时，菌丝体就停止生长，并产生自溶现象。实际生产过程中培养基采用自然状态时，即pH为5.5～6.5。当菌丝体的pH降到3.5时，其灵芝菌丝体中多糖含量已达到设计要求，故培养基中不再加入酸碱缓冲剂[11]。

2.6 培养基灭菌

罐内空消，蒸汽压力为1.5 kg/cm2。罐内实消，夹层加热至100℃，直接加热至120℃，蒸汽压力为1 kg/cm2，保温30 min。

3 发酵工艺

3.1 斜面菌种活化

将灵芝菌丝块接种于母种斜面培养基上,在温度26℃～28℃下培养6 d，活化1次[22]。

3.2 摇瓶培养

500 mL摇瓶装发酵液120 mL，接种4块0.5 cm2的等量菌块，使气生菌丝一面向上悬浮。置于培养箱内，在温度28℃下静置培养24 h。然后放入往复式恒温振荡器内，在温度25℃下，125次/min振荡培养，分别培养5、6、7 d，将长满灵芝菌丝球的一级菌种接入各组培养基中（接种量约10%），置于往复式恒温振荡器内培养[22]。

3.3 种子罐培养液培养

在50L全自动不锈钢种子罐中装30L种子液，121℃消毒30 min，冷却后采用火焰接种摇瓶种子液，接种量为10%（即：摇瓶种子培养液3000 mL）。培养条件：（28 ±1）℃，搅拌：150 r/min，罐压：0.2 kg/cm2～0.3 kg/cm2，pH控制在5.4[23]，空气流量：1∶1（体积比），培养时间：60 h左右，待菌丝球浓度6%左右（离心菌球和种子液重量百分比），并有浓郁的清香味，镜检菌球成鱼卵大小，菌丝锁状联合，无污染，生长旺盛的种子液即为合格的种子罐培养液[24]。

3.4 500 L罐发酵培养及放罐标准

在500 L全自动不锈钢发酵罐装发酵液300 L，121℃消毒30 min，冷却后接种子罐培养液30 L，接种量10%。发酵条件：罐温（28±1）℃，罐压:0.2 kg/cm2～0.3 kg/cm2，pH 控制在5.4，搅拌：150 r/min～200 r/min，通气量：1∶0.3～1.0（体积比），溶氧控制:100%～90%[25]，发酵周期:70 h。放罐标准：菌丝球浓度30%，残糖：1%以下，氨基氮：50 mg～100 mg左右，溶磷：380μg/mL左右，pH 降至3.0左右[24]。

4 生产过程中的影响因素

4.1 接种方式和接种量对发酵的影响

在接斜面种于摇瓶中时，有2种接种方式，一种是块接法，一种是用接种铲刮斜面。前者往往仅能得到十几个菌丝球，需要10 d甚至更长的时间才能得到适宜的种子，而后者则会得到非常多的菌丝球，菌丝球生长要迅速得多，6 d～7 d可得到生长良好的种子[26]。接种量是整个发酵的关健所在，灵芝深层培养菌种的菌龄一般为48 h左右[27]，始终保持在接种量10%，能大大提高设备的利用率，降低了发酵周期，减少了杂菌污染机会[11]。

4.2 发酵过程中培养基的pH变化和装液量对发酵的影响

深层发酵培养要求一定的pH范围，灵芝菌丝生长的最适pH为5.0～6.0，随着发酵的进行pH总体下降。发酵初期pH为4.0～5.4，到了发酵中期菌丝体生长旺盛，菌丝干物质和有效成分的积累，pH急剧下降到2.5～3.5之间，进入发酵后期菌丝生长缓慢，出现菌体自溶，pH回升。发酵过程中pH的变化和培养基的组成有密切的关系。在发酵过程中遇到pH急剧下降或上升，可通过选择合适的培养基，或控制加入酸或碱（氨）量，或加入磷酸盐、磷酸钙等缓冲物质来调节pH。工业生产上一般采用磷酸钙就可达到缓冲的目的[5]。

装液量对发酵过程也有影响。装液量越多，通气量就少，培养基中溶解的氧也少，使得菌球直径变大。氧对多糖合成有较显著的促进作用，而通气量对生物量和多糖含量影响很显著。研究发现，装液量为32%为佳[28]。

4.3 搅拌供氧对发酵的影响

发酵中的不同阶段，培养液中需氧和供氧情况都在变化，发酵开始0～8 h灵芝菌的需氧和供氧保持平衡，8 h～64 h发酵液溶氧降低，灵芝菌的需氧量大于供氧能力，在此阶段，菌体处在对数生长期，黏度一般在这个时期也会出现高峰阶段。所以64 h后加大搅拌桨的搅拌速度[24]。搅拌桨转速慢，培养基内的溶氧量少，菌球过大，而菌球中间的菌丝不能接触大量的氧气，处于饥饿状态，影响菌丝的生物量，转速提高菌体受到剪切力增强，使得菌球边缘的菌丝不断断裂成短菌丝，分散在培养基中。但转速不能太高，否则使正在生长的菌丝产生机械损伤，影响多糖的形成。综合考虑各指标确定搅拌转速为150 r/min[28]。另外，加长搅拌叶直径，都可改善通气，还可根据培养基的性质决定搅拌器的形式、搅拌流型等问题。灵芝菌丝体深层培养基黏度大、液面高，为了达到良好的搅拌效果，常采用两档或三档搅拌器，大型发酵罐多至四档[5]。但是机械搅拌会造成的大量泡沫。消除泡沫的方法有机械消沫和消沫剂消泡2种。机械消泡的优点在于不需要从外面加入物质，因此，减少了染菌的机会。但消泡效果不如消泡剂迅速可靠。灵芝深层培养的消泡剂为植物油，如豆油，用0.03%～0.035%，加油过量对菌丝体生长和代谢有一定影响。一般在培养基灭菌之前加入适量植物油外，在培养过程中若有泡沫上升可少量多次添加，但尽量少加油或不加油，而其他合成消沫剂不宜采用[5]。另外还可加入少量玻璃球来切断菌丝球表面的菌丝增加发酵点[28]。

4.4 温度的影响

温度能影响灵芝多糖的产量。在发酵过程中，前期0～30 h以稍高的温度促进菌丝迅速生长，这样可缩短非生物合成的周期。在30 h～150 h以稍低的温度尽可能延长有效物质的分泌期。150 h以后，温度稍微提高，以刺激有效物质的分泌。后期提高温度会促使菌丝较快衰老，但因接近放罐，影响不大[5]。

5 展望

灵芝属种质资源十分丰富,但是目前对灵芝的研究主要集中在赤芝（Ganoderma lucidum）和松杉灵芝（Ganoderma tsugae）2个种上，还有大量的物种资源尚待开发[29]。因此，加强对其他灵芝品种的研究，必会有意外的收获。另外，不同种、不同菌株间多糖和三萜的产量差异明显，药性差别大[30-32]。因此高产优质菌株的筛选是重要的研究方向，但是，目前多以菌丝产量、多糖产量和三萜产量为目标来筛选菌株，以药理活性为目标的筛选较少[33]。以药理活性为筛选目标的灵芝菌株研究应该成为今后灵芝生产菌株的研究方向。灵芝子实体和菌丝体间产生药理活性物质有一定的差异，加强有关方面的研究，加强药活性物质的合成途径的研究，从而优化生产。生产过程中，各种酶的活性影响着多糖和三萜的产量，目前灵芝菌丝体发酵中各种酶的活性和培养基组分、浓度的关系尚不清楚，加强该方面的研究可进一步优化培养基配比，甚至可选择性生产所需要的药理活性物质。

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Summarization of Deep-Liquid Fermentation of Ganoderma Lucidum Mycelia

ZHAO Xuan
（The College of Light Industry and Food，Zhongkai University of Agricultural and Engineering，Guangzhou 510225，Guangdong，China）

As the great source of a group of tripenes and biologically active polysaccharides，Ganodema lucidum were used as an anti－tumor medicine and cure some types of cancer.So it enjoyed special veneration in Asia.However，because of the lack of wild one and the difficulty of the cultivation，deep－liquid fermentation was an alternative method.This method in processing Ganoderma Lucidum mycelia will be summarized in this paper.

Ganoderma Lucidum Mycelia；deep－liquid fermentation；zymotechnique

赵翾（1977—），女（汉），讲师，博士，研究方向：发酵工程。

2011-03-10