食品中微生物检测新技术研究进展

张冲，刘祥，陈计峦

（1.新疆石河子大学食品学院，新疆 石河子 832000；2.国家加工食品质量监督检验中心（天津），天津 300384）

食品中微生物检测新技术研究进展

张冲1，刘祥2，*，陈计峦1

（1.新疆石河子大学食品学院，新疆 石河子 832000；2.国家加工食品质量监督检验中心（天津），天津 300384）

食品微生物是影响食品安全的重要因素，由食源性致病菌引起的病例越来越多。但致病菌往往共存于复杂的生物体系中，且数量极少、致病性高，因此，微生物检测方法要有高灵敏度、特异性以及较短的分析时间，现有的成熟检测技术尚难以实现对微生物进行实时、准确、快速的检测，因而许多新的检测方法已成为研究的热点。从微生物检测的角度出发，对逆转录聚合酶链式反应、叠氮溴化乙锭聚合酶链式反应、可视化基因芯片、荧光标记噬菌体等近年来出现的新型检测技术进行论述，并分析各自的优缺点。

逆转录聚合酶链式反应；叠氮溴化乙锭聚合酶链式反应；可视化；荧光标记；基因芯片；噬菌体

进入21世纪后，我国对于食品中微生物的检测、鉴定仍采用传统的方法，停留在分离培养、形态观察、生化鉴定和血清学分型水平，这些方法对微生物的检测特异性不高、灵敏度低、操作烦琐耗时，不能实现有效的监测和防控。因此，从食品安全现状和存在的关键问题出发，研究我国食品安全中的关键技术，建立符合我国国情的食品安全技术标准和检测体系，及时有效地控制和预防食源性致病菌的传播己迫在眉睫。本文对近10年发展的最新检测技术做了系统的比较和综述，旨在为今后该方法的研究应用提供一定的参考。

1 微生物检测的意义

食品微生物检测方法为食品检测必不可少的重要组成部分。首先，它是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检食品能否适用的科学依据之一。其次，通过食品微生物检验，可以判断食品加工环境及食品卫生情况，能够对食品被细菌污染的程度作出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人类、动物的食物中毒的防治措施。再次，食品微生物检验是以贯彻“预防为主”的卫生方针，可以有效地防止或减少食物中毒和人畜共患病的发生，保障人民的身体健康；同时，它对提高产品质量，避免经济损失，保证出口等方面具有政治上和经济上的重大意义。

2 可视化基因芯片技术

基因芯片以其高灵敏度、高通量的特点逐渐成为致病菌检测研究的热点，但普通的基因芯片在杂交反应结束后还需要使用荧光扫描系统进行结果分析，这就给配备简单实验室在使用上造成了一定的困难。为了解决基因芯片结果处理这一问题，开发了一种新的芯片技术——可视芯片技术。其原理是在酶的催化作用下产生的沉淀，沉积在芯片表面，使芯片的厚度发生变化，致使反射在芯片上的光的波长发生改变，由此可以通过芯片上颜色的变化来观察实验结果。

Ostroff[1]等首先阐述了可视芯片的原理，然后利用人工合成了金黄色葡萄球菌mecA基因，并同时合成了单个序列错误的片段，将它们用于单核苷酸错配的区别实验后，结果表明，可视芯片对区分不同的序列有很好的准确性，检测的浓度可以达到5 pmol/L；Jenison Robert[2]等对与捕获探针结合的芯片表面进行了改良，并将该技术用于IL-6，IL-1β及INF-γ 3种细胞因子的鉴别，以及ΔF508，G542X，G551D与N1303K型突变的SNP鉴别，发现可视芯片特异性高，准确性好，在混合检测中无交叉反应的情况出现；Zhong X[3]等利用可视芯片技术对MIF启动子的SNP差异进行了检测，并通过毛细管电泳法进行了验证，在30个样品中，只有1个样品的检测结果与毛细管电泳结果不同，其它的检测结果都与毛细管电泳结果一致。

可视芯片依赖于引物的扩增和探针的特异性结合，设计和筛选有效的、特异性强的引物和探针是建立可视芯片检测技术的关键，但这具有一定的难度；在理论上如果可视探针产生蓝色的杂交信号则即为阳性信号，但在实际检测中，背景和其它没有发生杂交反应的位点也可能会产生沉淀的堆积而造成表面颜色的改变。可视芯片检测技术虽然还不够完善，但其既有基因芯片快速、准确、高效、高通量的特点，又可以摆脱昂贵的基因芯片实验设备的限制，因此已成为国内外研究的热点。

3 荧光标记噬菌体技术

荧光标记噬菌体技术是根据噬菌体特异性侵染宿主菌的原理，选用一种合适的染色剂将噬菌体的核酸染色标记，然后用标记过的噬菌体侵染相应的宿主菌，噬菌体吸附在其宿主菌表面后，随即将标记过的核酸注入宿主细胞，随着越来越多的噬菌体核酸的注入，细胞内荧光随着荧光素的增多而增强，借助荧光显微镜便能判定宿主菌的存在，从而实现病原菌的检测。

Mosier-boss[4]等在前人的基础上，将荧光染料YOYO-1更换为灵敏度较高，且对噬菌体结构和功能都无破坏性的SYBR gold核酸染料标记沙门氏菌噬菌体P22，成功的检测到了沙门氏菌LT2株，同时与DAPI、EB、YOYO-1等核酸染料作对比，结果显示SYBR gold染剂是实验效果最好的核酸染料；Phea M H[5]与Flajshans M[6]等分别将SYBR greenⅠ和SYBR greenⅡ用于大肠杆菌、沙门氏菌、以及李斯特菌的检测，均已成功检出，且灵敏度较高，改方法完全能用于实际生产中微生物的检测。

多数噬菌体与宿主呈一一对应关系，虽特异性极高，但宿主范围较窄，且噬菌体与宿主作用的裂解机理尚不明确，有待进一步研究，所以该技术在实践中的应用相对较少。但是荧光标记噬菌体技术，检测周期短，能区分死活细菌，准确性好，检测前无需将各细菌纯化，预增菌后即可用于检测，整个过程可在8 h内结束，且多个细菌检测可同步进行，因此该项技术在食源性致病菌的检测中有着广阔的发展前景。

4 聚合酶链式反应（PCR）

PCR是体外选择性扩增DNA或RNA的技术，就是模板DNA、引物以及4种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）在DNA聚合酶的催化作用下所发生的酶促集合反应，由变性—退火—延伸3个步骤组成，应用该技术能在短时间内对特定DNA序列作百万倍扩增[7]。

目前在食品微生物检测中运用的PCR技术，大多是基于DNA水平的检测技术，虽然快速特异，灵敏度较高，但由于死菌中的DNA降解较慢，很容易产生假阳性结果[8]。因此，建立一种快速、灵敏高、特异性强，同时还能区分死、活菌，避免常规PCR中假阳性结果出现的方法很有必要。

4.1 EMA-PCR

EMA（ethidium bromide monoazide）是一种荧光插入型的核酸（DNA）结合染料，这种染料最显著的特点是当样品中死活细胞共同存在时，它能够选择性地与死细胞中的DNA共价结合。由于活菌的细胞膜比较完整，EMA不能渗透到活菌细胞内部；但在细菌死亡之后，细胞膜遭到破坏，EMA能够很容易地渗透到细胞内部，嵌插到DNA分子的双螺旋上[9]。有研究表明，死亡的细菌暴露于EMA染液中仅需1 min，EMA便可透过细胞壁或细胞膜，插入DNA的双螺旋，发生共价交叉偶合作用，使其不能发生扩增反应[10-11]，从而导致死细胞内部的DNA在接下来的PCR扩增过程中被抑制。

大量研究表明，EMA与PCR相结合的检测技术，能够有效地抑制样品中死细胞DNA的扩增，更精确地检测到样品中的活菌细胞[12-15]。Weimin Gu[12]等利用EMAPCR技术检测死、活类志贺邻单胞菌共存的菌液，发现EMA能够抑制志贺邻单胞死菌DNA的扩增，无假阳性的出现；Wang S.[9]等将创伤弧菌实验样品用EMA染液处理后，用real-time PCR成功的检测出样品中的活菌，并通过实验得出，不抑制活细胞PCR扩增的最大EMA浓度是3μg/mL，完全抑制死细胞PCR扩增的最小EMA浓度为2.5μg/mL；Pilar Viscogliosi[16]等用V-PCR（viability PCR：EMA与quantitative real-time PCR相结）对水中的军团杆菌进行了检测，并与普通培养法以及Q-PCR对比，发现V-PCR所得菌数高于普通培养法所得菌数，低于Q-PCR所得菌数，由此证明，EMA-PCR技术不仅能够避免常规PCR中死菌带来的假阳性结果，又能避免培养法中处于活的非可培养状态（VBNC）菌带来的假阴性结果；Wang L[17]等用EMA-real-time PCR的方法检测鸡肉与鸡蛋中活的沙门氏菌，并与常规PCR对照，结果显示无假阳性出现，并将其检出限降低至10 cfu/mL。

EMA-PCR与传统PCR相比，其最大优势在于在扩增时具有选择性，能够抑制PCR对死菌中的DNA扩增，只扩增其活菌的DNA[18-19]。但是，EMA选择死活菌的能力仍然受到一些质疑，EMA对微生物PCR扩增体系的影响还有很多地方尚不明确[20-23]，例如，EMA会抑制处于损伤状态的非死亡菌的扩增、EMA自身会对DNA产生破坏等。但EMA与Q-PCR相结合的方式，无疑为食品中微生物的检测提供了一个新思路，既能够弥补基于DNA水平的PCR法无法选择活死细胞的扩增不足，又具有常规PCR检验的高灵敏度、高特异性，因而具有较大的实用和推广价值。

4.2 RT-PCR

RT-PCR就是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的一种新的扩增方法。首先在反转录酶的作用下，将mRNA反转录合成cDNA，即用引物与mRNA杂交，然后由RNA依赖的DNA聚合酶（反转录酶）催化合成相应互补的cDNA链，最后再以反转录合成的cDNA为模板，借助PCR技术扩增合成目的片段。其最大优点在于，利用了只有活菌的DNA才能转录出RNA的原理，用RNA反转录出cDNA做为扩增的目标片段，以解决死菌DNA带来的假阳性问题。

Vijay K.Sharma[24]采用rRT-MPCR（real-time reverse transcription multiplex polymerase chain reaction）技术，用2对引物和探针对大肠杆菌O157:H7进行检测分析后，认为以总RNA为模板，rfbE与eae为靶点的RTPCR是一种特异性强，灵敏度高的快速检测方法；Matsuda[25]等以传统培养法以及常规PCR为对照，用定量反转录PCR（Q－RT－PCR）方法检测到了处于活的非培养状态（VBNC）的C.perfringens菌，说明RT-PCR具有较强地区分死、活菌的能力；Carlos A.Guzman[26]等用QRT-PCR（real-time quantitative reverse transcription PCR）方法成功的检测出处于活的非可培养状态与饥饿状态的霍乱弧菌，因此证实，Q-RT-PCR不仅可以避免常规PCR在检测霍乱弧菌时出现的假阳性结果，还可以检测到代谢较弱的霍乱弧菌，由此证明，基于RNA水平的PCR技术检测结果，可以显示细菌当前的代谢活性，进而可以对细菌的代谢活性作出科学的评估；Narjol Gonzalez-Escalona[27]等用Q-RT-PCR技术，以沙门氏菌invA基因为靶点，并设置myIC内参，成功的避免了假阳性以及假阴性的出现，并且准确定量出体系中的活菌数量，从而证实，Q-RT-PCR是一种快速而精确的检测方法。

RT-PCR技术已经广泛的应用于临床医学、分子生物学、微生物学等领域，一度被称为活菌检测的“金”标准[28]，但仍有一些不确定因素限制了RT-PCR的使用[29-35]，如样品的选择、靶点RNA的选择、逆转录体系的选择、扩增方式的差异等。但RNA作为生物活性的标志，RT-PCR不仅能够有效地区分死活菌，其检测结果还能作为菌体代谢的活性指标，因此，RT-PCR有着极其重要的研究价值。

5 结论与讨论

与传统方法相比，这些新的检测技术具有明显的优势，不但快速方便、特异性强、灵敏度高，且能够检测到一些传统方法难以检测到的病原体；与其它生物学检测技术相比，如：依赖核苷酸序列扩增技术(NASBA)、酶联免疫吸附技术 (ElISA)、免疫金技术（ICGT）、固相细胞计数（SPC）等，具有操作简单、检测成本低的特点。尤其是RT-PCR技术，不但能够检测到活性较强的细菌，而且还能够检测到处于VBNC状态下的细菌，具有较强的区分死活菌的能力，其检测结果可作为菌体活性评估的重要参照，这是其它快速检测技术以及传统检测技术均无法比拟的优势，因而有着不可估量的发展前景。

总之，这些新的检测技术在食品微生物检测方面均发挥着一定的作用，不同的检测技术具有不同的适用范围，可以满足差异化的检测需求。随着研究的深入，各种检测技术得到不断发展与完善，传统的食品微生物检测技术将逐步被各种简便、快速、高灵敏度的新型检测技术所取代。

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New Method for Detecting Microorganisms in Food Progress

ZHANG Chong1，LIU Xiang2，*，CHEN Ji－luan1
（1.College of Food Science and Engineering in Shihezi University，Shihezi 832000，Xinjiang，China；2.National Quality Supervision and Inspection Center of processed foods（Tianjin），Tianjin 300384，China）

Food microbiology is an important factor affecting food safety，foodborne pathogens caused by the increasing number of cases.However，pathogens often coexist in complex biological systems，and few in number，high pathogenicity，therefore，microbial detection methods have high sensitivity and specificity and short analysis time，but our existing detection methods had been difficult microorganisms to achieve real－time，accurate，rapid detection，so many new detection methods had become a research hotspot.The significance of this departure from the microbial detection of RT－PCR，EMA－PCR，gene chip visualization，detection of fluorescent phage and other new technologies were discussed，and analyzes their advantages and disadvantages.

RT－PCR；EMA－PCR；visualization；fluorescent marker；gene chip；phage

国家质检总局科技项目（2010QK307）；天津市质监局科技项目（10-11）

张冲（1988—），男（汉），在读硕士研究生，主要从事食品科学与分子生物学研究。

*通信作者

2011-07-01