鼻咽癌患者外周血EBV DNA水平与癌组织细胞凋亡的相关性

刘 飞

(河南省人民医院，郑州450000)

EB病毒(EBV)是传染性单核细胞增多症的致病原，属于嗜 B 淋巴细胞病毒属成员［1，2］。研究显示，EBV与人类多种恶性肿瘤相关，其中与鼻咽癌密切相关［3，4］。鼻咽癌患者外周血EBV DNA水平，与病灶的残留、复发、转移、评价疗效以及患者的预后均显著相关，但EBV DNA是如何进入血液循环的，目前尚不清楚。2008年12月～2010年12月，我们观察了鼻咽癌患者外周血EBV DNA水平与癌组织细胞凋亡的相关性，为阐明外周血EBV DNA的来源提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 鼻咽癌22例，男14例，女8例;年龄28～62岁，平均37.5岁;均行手术治疗，术中留取癌组织，病理确诊为鼻咽低分化鳞癌;患者术前均未行放化疗。

1.2 外周血EBV DNA检测 采用荧光定量PCR法。采集鼻咽癌患者外周静脉血0.5～1 ml，EDTA抗凝;1 500 g离心10 min，吸取上层血浆;按照DNA提取试剂盒说明操作，提取的DNA加入50 ml TE缓冲液(10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)，置－20℃冰箱保存，用ABI7900荧光定量PCR仪检测EBV DNA表达。EBV DNA:上游引物为5'-TCTCTGCCTCCAGGCAAG-3'，下 游 引 物 为 5'-AGAGGGCCTGTCCACCGT-3'。反应条件:95℃ 5 s，58℃ 45 s，45个循环。阳性定量参考品为EBV DNA的BamHI-W片段，阴性对照为阴性质控品，均由试剂盒提供。

1.3 鼻咽癌细胞凋亡检测 取术中分离的鼻咽癌组织，用0.1%胶原酶消化制成单细胞悬液;冰上操作，500 ml PBS缓冲液悬浮细胞;按照试剂盒说明加入 Annexin V 和 PI各50 μl，反应 30 min;上流式细胞仪检测，读取细胞凋亡率。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计量资料比较用t检验，相关关系采用Spearman相关分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

本组患者外周血EBV DNA检出率为86.5%(19/22)、中位数为2 200拷贝/μl，癌组织细胞凋亡率为33.27%±13.46%;EBV DNA阳性鼻咽癌患者癌细胞凋亡率为35.93%±12.42%，EBV DNA阴性患者为16.47%±4.83%，两者比较，P ＜0.05;相关分析显示，鼻咽癌患者外周血EBV DNA拷贝数与癌细胞凋亡率呈正相关(r=0.517，P ＜0.01)。

3 讨论

鼻咽癌在国外发病率不到1/10万，但在我国华南地区甚至可达30/10万［5，6］。EBV是一种在自然界普遍存在的双链DNA病毒，人群感染率约在90%以上。鼻咽癌是第一个被发现与EBV感染有关的人类恶性肿瘤。研究表明，EBV可作为鼻咽癌的肿瘤标志物，并在鼻咽癌的早期筛查、诊断，肿瘤分化程度、疗效和预后评估以及肿瘤的复发、转移等方面都有着重要意义［3，4］，但 EBV DNA 是通过何种途径进入患者的血液循环目前并不清楚。其可以是病毒在肿瘤细胞内繁殖后释放入血，也可以是肿瘤细胞凋亡后释放到血。

外周血EBV感染检测的方法有很多种，例如EBV-VCA-IgA ELISA法;但其敏感性和特异性都受到限制，且其主要反映的是机体对EBV的免疫功能，并不能完全反映体内病毒的表达丰度［7］。因此，我们选用荧光定量PCR法，其不仅可精确定量病毒的拷贝数，更能准确反应体内病毒表达的变化。细胞凋亡检测方法有DNA裂解带、凋亡小体、dUTP原位切口末端标记、磷酯酰丝氨酸(PS)外翻、凋亡相关因子活性等，其中Annexin V/PI双染法是一种特异且敏感的凋亡检测方法，通过流式细胞仪可对凋亡细胞的比例精确定量［8］。本研究使用上述两种精确定量方法检出86.5%的鼻咽癌患者外周血中存在EBV DNA表达，肿瘤细胞中存在细胞的自发性凋亡;EBV DNA阳性患者癌细胞凋亡率为35.93%±12.42%，而 EBV DNA 阴性者为 16.47%±4.83%;且相关分析显示，鼻咽癌患者外周血EBV DNA拷贝数与癌细胞凋亡率呈正相关(r=0.517，P ＜0.01)。由此可见，鼻咽癌患者血液循环中的EBV可能来源于肿瘤组织中的凋亡细胞。

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