兔激素性股骨头缺血性坏死模型 BMSCs超微结构观察

巩 凡，张 焱，白志刚，牛东生*

(1宁夏医科大学，银川 750004;2宁夏回族自治区人民医院)

激素性股骨头缺血性坏死(SANFH)是因为大量应用皮质类固醇类激素，造成股骨头内骨细胞、血管内皮细胞等死亡或凋亡所引起的病理过程。骨髓间充质干细胞 (BMSCs)是一种主要存在于骨髓中，具有多向分化能力的干细胞。2010年 3月，我们观察了兔 SANFH模型的 BMSCs的超微结构，探讨SANFH的成因及对骨修复的影响机制。

1 材料和方法

1.1 材料 健康成年新西兰大白兔 10只(体质量2.5～3.0 kg，由宁夏医科大学动物试验中心提供);马血清(郑州益康生物工程有限公司);醋酸泼尼松龙(25 mg/ml，中国浙江仙据制药股份有限公司);青霉素钠:0.48 g(80万 U，石药集团中诺药业有限公司);Percoll细胞分离液(Pharmacia 1.073 g/ml);L-DMEM(Gibco公司);PBS(Sigma公司 );肝素钠注射液(12 500 U/2 ml，江苏万邦生化医药股份有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备 参考相关文献[1]，10只健康的成年新西兰大白兔分笼喂养，适应性饲养 3 d后每只经耳缘静脉注射马血清 10 ml/kg 1次，间隔两周后再注射 1次。继续喂养两周后肌肉注射醋酸泼尼松龙 8 mg/kg，间隔 1 d注射 1次，共 5次。继续喂养 3～5周后行 X线检查，观察结果。结果发现骨小梁中出现大量空骨陷窝及核固缩现象，符合激素性股骨头缺血性坏死的病理学定义[2，3]，说明制模成功。为预防感染，所有试验动物每周给予肌肉注射青霉素钠 20万 U/只。

1.2.2 细胞分离及超微结构观察 予制模前及制模后 2个月行骨髓细胞分离:将新西兰大白兔俯卧位固定于手术台上，3%戊巴比妥钠 1 ml/kg(30 mg/kg)耳缘静脉缓慢注射麻醉，备皮，碘伏消毒皮肤。选取股骨近端外侧将 F16骨髓穿刺针定位，待骨髓穿刺针有明显落空感时，抽出穿刺针内芯，于穿刺针尾部接入 10 ml注射器(内含 12 500 U肝素 1 ml)负压抽吸，每次穿刺抽取 5 ml骨髓液。抽取的骨髓立刻进入无菌间，与等体积的不含血清的 L-DMEM培养基混匀，500 r/min离心 5 min，弃上清液，用 5.0 ml不含血清的 L-DMEM培养基混匀，缓慢加入预先加有 5.0 ml密度为 1.073 g/ml的 Percoll分离液的离心管内，使其位于 Percoll分离液的液面上，静置 5 min，1 500 r/min离心 30 min。可见管内液体分为四层，最上层约占液柱的 1/2，为红色的培养液层，第三层约占液柱的 1/2，为乳白色的 Percoll分离液层，两层交界处为高约 1.0 mm的灰白色云雾状层，为单个核细胞层，底层紧贴试管壁，为一薄层红色细胞层，为红细胞等。小心吸去最上层的红色培养液，缓慢加入 2%戊二醛固定 2 h(4℃)，待灰白色云雾层固定成块后，小心将固定块挑出，放入小瓶中，4℃、2%戊二醛继续固定 30 min，换 0.1 M二甲砷酸钠缓冲液冲洗 3次，0.1 M二甲砷酸钠缓冲液保存(4℃)。1%锇酸浸泡染色 2 h(4℃)。梯度乙醇脱水。环氧丙烷渗透 2次。完全树脂包埋后入模具。修整模块，切片，定位，超薄切片，于电镜下观察细胞超微结构变化。

2 结果

制模前 BMSCs:低倍下见少量红细胞及两个并排的 BMSCs，细胞核较大核膜完整;细胞质丰富，电子密度均一，细胞器结构清晰。并可见另一 BMSCs，细胞质浓缩聚集，核膜不完整;细胞质电子密度增高，其间细胞器结构不清。高倍下见双层核膜完整，细胞核较大，染色质分布均匀，核内染色质丰富，核孔较多;细胞质丰富，电子密度均一，细胞器丰富，线粒体、内质网等细胞器结构清晰。制模后 BMSCs:低倍下见少量红细胞及一个淋巴细胞。其中可见两个细胞出现染色质浓缩、聚集并出现凋亡小体。高倍下见胞体变小，胞质基质密度增加。细胞核不完整，核膜模糊，染色质固缩、凝集;细胞质浓缩，电子密度增高，胞质内见大小不等的空泡及大量脂滴，细胞器结构不清。

3 讨论

BMSCs能够分化为多种组织细胞，包括骨、软骨、脂肪、肌腱细胞等。关于激素性股骨头缺血性坏死的致病原因，目前尚有争议，其中以骨质疏松、血液高凝状态、血管内凝血、脂肪代谢紊乱、骨内高压等较为普遍。激素性股骨头缺血性坏死的致病过程极其复杂[2]，上述原因并不是孤立存在，而是相互联系。其中脂肪代谢紊乱学说认为与激素导致骨髓内脂肪细胞聚集、肥大有关[3]。研究发现，动物应用激素后股骨头内脂肪细胞肥大，并见大的脂肪滴形成;而脂肪滴旁发现的间充质干细胞普遍出现功能障碍的特征:①胞质内空泡形成:可能是线粒体和内质网肿胀所致，说明细胞有氧呼吸及蛋白合成可能受到干扰;②自噬体出现:提示细胞出现衰老;③胞质内大量脂滴出现:说明细胞的脂类代谢功能可能受到影响。本研究结果显示，应用激素前只有少量 BMSCs出现了凋亡，此与成年动物细胞正常衰老有关。应用激素后大量的 BMSCs出现凋亡或细胞器受损，胞质中看到空泡和大量脂滴形成，提示激素可能通过影响细胞的正常脂类代谢使其过早出现功能异常，并可能引发其启动凋亡程序，此进一步印证了 Wang等[4]的研究，他们发现大量使用糖皮质激素可以使BMSCs减少;其在对成骨细胞的观察中胞质内没有发现脂滴，仅看到肿胀的线粒体及自噬体，证明有氧呼吸被干扰没有引起脂类代谢紊乱。

本研究中采用 Percoll细胞分离液分离 BMSCs后不经培养，直接固定，减少了细胞培养对细胞状态的影响及各种人工培养液对细胞器的损害，观察到的细胞状态更符合其体内状态，结果与乔东访等[5]体外培养的兔 BMSCs观察结果一致。

本研究发现，激素导致股骨头缺血坏死的可能机制为通过对血液系统的干扰，影响股骨头内各种细胞的有氧呼吸;又通过干扰 BMSCs的脂类代谢影响骨的修复，最终导致股骨头坏死塌陷。

[1]李子荣，张念非，岳德波，等.激素性股骨头坏死动物模型的诱导和观察[J].中华外科杂志，1995，33(8):485-487.

[2]Mont MA，Jones LC，Elias JJ，et al.Strut-autograft with and without osteogenic protein-l:a primary study of a canine of femoral head defect model[J].J Bone Joint Surg Am，2001，83(7):1013-1022.

[3]Wang GJ，Lennox DW，Rteven SL，et al.Cortisone-in-duced intra femoral head pressure change and its response to a drilling decompression method[J].Clip Ortho Relat Res，1981，(159):274-278.

[4]Wang BL，Sun W，Shi ZC，et al.Decreased proliferation of mesenchymal stem cells in corticosteroid-induced osteonecrosis of femoral head[J].Orthopedics，2008，31(5):444.

[5]乔东访，路艳蒙，傅文玉，等.体外培养兔骨髓间充质干细胞的超微结构观察[J].电子显微学报，2002，21(5):491-492.