骨质疏松症大鼠血液中碱性磷酸酶来源方式探讨

林社裕，谭湘陵

(南通大学生命科学学院，江苏南通 226007)

当前国内外的骨质疏松症的研究主要集中于骨质疏松症的病因及各种生化检测指标[1～6]。关于骨质疏松症患者血清碱性磷酸酶(ALP)水平目前报道不一，其来源方式亦存在争议。有学者认为系骨质疏松症发生时静止的成骨细胞变为活跃的成骨细胞，释放大量的 ALP入血所致;据此理论治疗后ALP应进一步升高，但事实却与此相反。2009年，我们检测了骨质疏松症大鼠血清 ALP水平，现分析结果并探讨其来源方式。

1 材料与方法

1.1 材料 40只健康 SD雌性大鼠，4个月龄，体质量 250～280 g，由南通大学实验动物中心提供。正置金相显微镜(Leica DM2500);冰冻切片机(Lei ca CM1900);地高辛随机引物标记检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);即用型 SABC免疫组化染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);DIG DNA标记试剂盒(上海美季生物技术有限公司);尼龙膜(罗氏公司);Rabbit Anti-Alkaline Phosphatase(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 模型制备及 ALP检测 将 40只大鼠随机分为模型组和假手术组(对照组)各 20只。模型组腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，无菌环境下打开腹腔，摘除卵巢，腹腔分层缝合，肌注青霉素(2万 U/只)。对照组不卵巢摘除，其他操作与模型组相同。术后 3个月两组均颈椎脱臼处死，取股骨去尽肌肉与结缔组织，截取相应骨组织浸入 4%多聚甲醛中固定 3 d，再浸入 4%EDTA溶液中室温脱钙 4周，每周换液1次。脱钙完成后，取骨组织制作冰冻切片(切片厚度 10μm)，贴片于包被多聚赖氨酸的载玻片上行ALP检测。①ALP mRNA:采用原位杂交法。冰冻切片首先探针制备(PCR法)，效价验证;室温风干，0.1 MPBS浸 10 min，0.1 M甘氨酸/0.1 MPBS浸 5 min，0.3%TritonX-100/0.1 M PBS浸 15 min，0.1 M PBS洗 3次，蛋白酶 K 37℃孵育 30 min，4%多聚甲醛浸 5 min，0.1 M PBS洗 2次，浸入新鲜配制的含0.25%乙酸酐/0.1 M三乙醇胺中10 min，预杂交 42℃ 30 min，42℃杂交过夜，洗片，3%BSA/0.05 M PBS包被 30 min，滴加抗地高辛-HRP标记的一抗，4℃孵育过夜，0.05 M PBS洗 4次;TSM1洗 2次，TSM2洗 2次，显色，乙醇梯度脱水、二甲苯脱脂，中性树胶封片，显微镜下观察。②ALP蛋白:冰冻切片室温风干，多聚甲醛固定，H2O2室温浸泡，蒸馏水洗，5%BSA封闭，加一抗、二抗，DAB显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片，显微镜下观察。原位杂交和免疫组化图片应用 Scion Image软件固定，随机选择 5个视野行灰度值检测。

1.3 统计学方法 采用 SPSS15.0统计软件。多组计量资料均数比较应用单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

模型组 ALPmRNA染色强度明显低于对照组，且其表达主要位于骨组织边缘，两组 ALPmRNA表达的灰度值分别为 43.64、62.42(P＜0.01)。两组ALP蛋白表达特点与 ALP mRNA相同，亦主要位于骨组织边缘。模型组及对照组 ALP蛋白表达的灰度值分别为 49.8、90.7(P＜0.01)。

3 讨论

根据免疫组化结果可以看出，经过去势后，模型组 ALP含量明显降低。原因为去势后，大鼠体内的雌激素的分泌量减少，破坏了体内的激素的平衡，影响了机体的正常代谢，对骨骼而言，出现了破骨细胞骨吸收活性增强，而成骨细胞的骨形成活性有所减弱，打破了骨骼重建的动态平衡[7]。ALP主要由成骨细胞产生，主要作用是产生磷酸基团，促进钙沉积及骨重建[8]。一旦这种状态打破，就会导致更多的成骨细胞破坏，成骨细胞中的 ALP便释放到血液中，引起血液中 ALP活性升高。本研究结果显示，去势后大鼠骨组织 ALP mRNA及 ALP蛋白表达均显著降低，即二者的降低是同时发生的;但尚不能推断血液中 ALP活性升高是成骨细胞活性增加，进而增加了 ALP合成并分泌到血液中所致。因为如果血液中 ALP活性升高时系成骨细胞分泌增加所致，那么对照组 ALPmRNA表达理论上应低于模型组，而本研究结果正好相反。因此，有理由认为骨质疏松的可能机制为雌激素水平降低，导致破骨细胞的骨吸收增强，成骨细胞的骨形成活性降低，大量的成骨细胞被破坏，导致细胞中的 ALP流失进入组织液或血液，引起血液中 ALP活性升高。

骨质疏松的发生是因为骨骼重建的动态平衡遭到破坏，成骨细胞大量破坏。而药物治疗骨质疏松症的目的主要是抑制骨吸收，促进骨形成。因此恢复成骨细胞活性，促进成骨细胞增殖，减少成骨细胞破坏是治疗关键。骨 ALP作为骨形成的重要功能酶之一，并且是骨转换或骨形成的重要标志分子;有文献报道，骨髓基质干细胞在向成骨细胞分化时，骨组织 ALP变化比其他指标更敏感[9];此外亦有报道，药物治疗后血液 ALP恢复到正常水平[7，10]。结合本研究结果，成骨细胞的骨 ALP主要是细胞原位表达，而不是以分泌为主。综合以上结果，骨组织ALP水平可作为其他细胞向成骨细胞分化的一个鉴定指标。本研究的不足之处是未进行体外成骨细胞培养上清及细胞内 ALP活性检测;检测指标单一。上述问题将在以后的实验中加以解决。

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