自体骨髓干细胞移植治疗肝硬化研究进展

刘卫 朱斌

肝脏是人体重要的消化器官，具有强大的物质代谢、合成、生物转化等功能。各种原因导致的终末期肝病患者内科治疗疗效欠佳，病情常不能逆转，病死率高。晚期肝病的治疗已经成为整个世界范围内的医学难题，现在治疗终末期肝病最有效的手段是肝移植。但肝移植费用昂贵，加之供肝来源紧张，于是人们把更多的注意力转到了再生医学上，即通过干细胞移植治疗，以求恢复肝脏的物质代谢功能。经过多年对干细胞的研究，骨髓干细胞（bone marrow stem cells，BMSCs）移植已经在国内外得到广泛应用。近年来对自体骨髓干细胞移植治疗肝硬化的研究也逐渐深入。经过动物模型及临床研究，已经证实其治疗的有效性，并且此方法还具有操作简单、创伤小、不存在排斥反应、并发症少、费用低等优点。本文就自体骨髓干细胞移植治疗肝硬化的研究进展作一综述。

一、干细胞的生物学特性

干细胞是指未经分化的、具有自我更新能力及能分化为多种细胞系的潜能细胞，分为胚胎干细胞和成体干细胞，在成体的组织和器官中存在多种干细胞：如BMSC、肝干细胞、脂肪源性干细胞、外周血干细胞等。BMSC最早由Friedenstein等于1966年发现。此后，不同的研究小组对骨髓来源的并与BMSCs相似的干细胞进行了一系列的研究，并赋予其不同的称谓：如骨髓间质状干细胞（bone marrow stromal stem cell，BMSSC）、间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）、成人骨髓多分化诱导细胞（marrow-isolated adult multipotent inducible cells，MIAMI）、成人多分化祖细胞（multipotent adult progenitor cells，MAPC）、成人间充质干细胞（mesenchymal adult stem cells，MASCS）等[1～3]。这些研究均证实了MSCs类细胞具备多向分化潜能。虽MSCs不能无限增殖，但在良好的培养环境下可扩增许多倍后仍能保持增殖能力及具有多向分化潜能。MSCs能分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、心肌细胞、成纤维细胞、上皮细胞、神经细胞、非中胚层的胰岛细胞和肝细胞等[4，5]。

二、干细胞与肝脏

1999年，Petersen等[6]报道了肝细胞具有骨髓源性。骨髓干细胞分为造血干细胞（hemopoietic stem cells，HSCs）和MSCs。一些学者提出骨髓间充质干细胞是最有效的肝细胞分化来源细胞[7]。BMSCs向某种细胞系分化取决于培养环境，尤其依赖于生长因子的诱导。一些化学药物亦能影响BMSCs的分化方向，如将BMSCs与地塞米松、胰岛素、异丁基黄嘌呤及吲哚美辛等混合培养后，能向脂肪细胞分化。BMSCs向肝细胞分化亦是一个较为复杂的过程。Sarah等[8]对健康成人获取的MSCs进行培养，加入20ng/mL的EGF、10ng/mL的FGF、20ng/mL的肝细胞生长因子（HGF）、20ng/mL的绵羊颌下黏液蛋白、地塞米松、烟酰胺及苯磺酸等物质后，同样能获得成熟的肝细胞，且分化而来的肝细胞具备完整的功能。有关研究证实，在肝脏的微环境中，干细胞能够分化为有功能的肝细胞并增殖。Petersen等[6]通过动物实验证实了小鼠骨髓干细胞可以分化为肝细胞和胆管细胞。Okumoto等[9]用含有细胞外基质并加入高浓度的HGF的培养基培养小鼠BMSCs，发现BMSCs分化为肝细胞系并增殖，并能表达白蛋白。以上研究表明，干细胞具有分化为成熟肝细胞的潜能，在适宜的微环境中，干细胞能被诱导分化为肝细胞，并表达成熟肝细胞的特异性因子。

研究表明，骨髓干细胞不仅能通过再生肝细胞来部分恢复肝细胞代谢功能，还能分泌基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP），特别是 MMP-9，降解肝脏间质纤维组织来改善肝脏纤维化和肝硬化[10，11]。陈国忠等[12]发现骨髓干细胞与肝星状细胞共培养能抑制星状细胞增值及促进其凋亡。

三、骨髓干细胞的提取和分离

骨髓干细胞的分离是临床治疗的第一步。获取高质量的供体细胞是关键，有时甚至直接影响治疗效果。

骨髓干细胞分离方法较多，常用的干细胞分离方法有：贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法和免疫磁珠分离法等。临床上较为常用的是Oh SH[13]及Wollert[14]等报道的密度梯度离心法。该法较为简便，实用性强，适合临床使用：在层流无菌治疗室内，选患者双侧髂后上棘为采髓点，常规消毒铺巾局麻后，18号骨髓穿刺针穿刺，抽取骨髓 65～95ml左右，以4000U肝素抗凝，避免污染。离心去除脂肪层，用等量DMEM培养液稀释骨髓，制成细胞悬液。轻轻加到密度1.073/ml的Percoll分离液上，室温下以1200rpm离心25min。吸取界面细胞层，用生理盐水洗脱，1500rpm离心5min×3次。生理盐水重悬细胞，镜下计数。

四、治疗

目前，临床常用的有同种异体骨髓干细胞移植及自体骨髓干细胞移植，但同种异体骨髓干细胞移植面临着缺乏供体细胞、移植细胞被排斥等问题，而自体骨髓干细胞移植则很好地解决了这些矛盾。

骨髓干细胞肝脏移植的方法包括：经门静脉移植、经股动脉移植、脾内移植、外周静脉移植、肝内移植、腹腔移植等。门静脉移植：分为经皮肝内门静脉移植和剖腹肠系膜静脉或借助腹腔镜门静脉移植两种方式。后一种方式创伤较大，较少应用。经皮肝内门静脉移植方法的技术成熟，且创伤相对较小。通过门静脉移植BMSCs的方法符合肝脏组织学及生理学特点，细胞更易进入肝窦中[15]。经股动脉介入移植：在X线监视下，经股动脉穿刺，将分离的骨髓干细胞通过导管从肝动脉缓慢注入到病肝内，之后用10 mL生理盐水冲洗管腔，注射速度为1 mL/min[16～18]。由于介入治疗的广泛开展，对其技术掌握也很熟练，此方法在骨髓干细胞移植中应用较多。腹腔移植：此方法创伤较小，且可移植较大数量的干细胞，但其缺点是干细胞在腹腔内较难存活。Liu等[19]用生物包裹的BMSCs移植到90%肝脏被切除的同种异体小鼠腹腔，小鼠的肝功能改善，生存率明显提高。外周静脉移植：Terai等[14]对9例肝硬化患者通过外周静脉将5.20±0.63×109单个核细胞注入体内，细胞的存活率超过了90%，术后肝功能改善明显。脾内移植：将干细胞注入脾内，干细胞从脾脏通过门静脉缓慢进入肝实质，可以避免从门静脉直接注射引起栓塞的可能。Ju等[20]将大约6×106个骨髓间充质干细胞注入肝硬化小鼠脾内，3小时后在小鼠肝内检测到骨髓干细胞。

姚鹏等[16]对20例慢性肝衰竭患者进行自体骨髓干细胞移植治疗，未发现严重并发症，术后有轻度恶心1例，发热1例；在移植8周后，患者丙氨酸转氨酶、总胆红素、直接胆红素均逐渐降低，白蛋白逐渐升高，凝血酶原活动度逐渐上升；张强[21]等的研究表明，移植后大多数患者症状明显改善，腹水减少，食欲改善，体力好转，睡眠改善。其中3例肝硬化Child-Pugh C级患者取得了较好的疗效，提示肝脏损害严重的肝硬化患者肝内移植骨髓干细胞仍然可以获得较好的效果。Khan等[22]选择4例肝硬化患者，在自体骨髓干细胞移植治疗术后6个月的随访中，3例患者血清白蛋白升高、1例无变化。Terai等[17]报道在9例肝硬化患者，采用自体骨髓干细胞外周静脉注射到患者体内，术后第一天9例患者均出现发热（约38℃），无其他副反应。移植24周后观察发现所有患者血清白蛋白、总蛋白及Child-Pugh评分均有显著提高。Levicar等选择5例慢性肝病患者，通过门静脉（3例）及肝动脉（2例）将自体骨髓干细胞移植到肝脏内，移植细胞数量为1×106至2×108之间，连续随访12～18个月显示所有接受细胞移植的患者均较好的耐受了移植治疗，其中4例患者白蛋白增加并一直保持不变，所有患者甲胎蛋白均保持在正常范围内，未见肝脏肿瘤及局部肝损害发生，未见严重的并发症和副反应发生[23]。最近，郭晓钟等报道，对78例肝硬化患者行自体骨髓干细胞移植治疗，在移植4周后，患者丙氨酸转氨酶明显降低，白蛋白、PTA明显上升、Child-Pugh评分显著提高，腹水明显减少或消失，乏力纳差改善[24]。

通过目前的临床观察，干细胞移植治疗肝硬化已经表现出了明显的治疗效果，肝功能得到改善，减少了患者的痛苦，改善了生活质量，提高了生存率，并且未出现严重的并发症和副反应。

五、自体骨髓干细胞移植治疗肝硬化的相关问题

在各种病理条件的微环境下，干细胞向各种组织细胞分化的机制还不清楚，在移植干细胞后，会不会引起肿瘤细胞的分化和增殖，还需要通过长期的实验和临床来证实。目前，自体骨髓干细胞移植治疗肝硬化开展的时间才三年多，患者的远期疗效及是否有其他并发症还有待观察。对于干细胞移植治疗的适应证、禁忌证、移植途径的选择、移植干细胞的数量、移植次数等还没有相关的标准，还需要不断的完善和规范。

六、展望

二十一世纪将会是细胞治疗的时代，干细胞移植治疗肝硬化的诸多优点，使得它非常适合我国的国情。我国的干细胞临床治疗起步早，开展范围广，有较好的临床经验，取得了较好的效果，为我们的干细胞研究奠定了一个非常好的基础。同时，干细胞移植也为我们在某些重症疾病的治疗上带来了希望，是我们以后基础研究和临床治疗发展最前沿的方向。

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