转基因骨髓基质细胞治疗缺血性脑损伤的研究进展

付霞 何志义(审校)

转基因骨髓基质细胞治疗缺血性脑损伤的研究进展

付霞 何志义(审校)

一、骨髓基质细胞的概述

骨髓基质细胞(marrow stromal cell，MSC)是骨髓内除造血干细胞之外的非造血干细胞，通常称之为间充质干细胞(mensenchymal stem cell)，非造血干细胞(nonhematopoietic stem cell)或成纤维细胞形集落(colony-forming-unit fibroblast)。早在1867年，德国病理学家Cohnheim在研究创伤愈合时就提出了骨髓中存在非造血干细胞的观点［1］。20世纪70年代中期Friedenstein等［2］首先利用骨髓基质细胞贴壁生长的特性，通过贴壁培养的方法分离得到了骨髓基质细胞。

以前认为骨髓基质细胞主要起支持作用和分泌各种因子、调节造血细胞的增殖和分化。近来研究表明骨髓基质细胞具有非造血组织干细胞的功能，有极大的可塑性，可因外周的微环境的不同，分化为多种组织细胞［3］。由于骨髓基质细胞取材方便，体外易于分离和扩增，多种外源目的基因可以转染至骨髓基质细胞基因组DNA中，并能长期表达，移植到体内后免疫原性较弱，能够通过血脑屏障，与宿主大脑细胞整合，通过自我更新而长期存活，因此骨髓基质细胞成为了一种理想的基因治疗缺血性脑损伤的靶细胞。

二、转染髓基质细胞常用的载体

基因治疗的前提是将外源基因有效导入靶细胞并适量的表达，因此合适的基因转移载体是决定基因治疗效果的关键。目前实验中常用的载体主要包括病毒载体和非病毒载体两大类，这两类载体各有优缺点:病毒载体由于其较高的转染效率而被广泛应用，但是病毒载体不仅难以操控，而且存在一些安全隐患，比如:免疫反应、感染，以及由于基因改变造成细胞的恶性变或永生化;而非病毒载体虽然转染效率低于病毒载体，但其具有置备程序比较简单，外源基因容量大，不受靶细胞分裂周期的影响，以及毒性低等优点。

1.病毒载体:目前实验中常用于转染骨髓基质细胞的病毒载体有腺病毒载体(adenovirus vector)、慢病毒载体(lentivirus vector)、单纯饱疹病毒载体(herpes simplex virus vector)以及逆转录病毒载体(retroviruses vector)等。

(1)腺病毒载体:腺病毒载体是目前转基因试验中最常用的病毒载体之一，其具有宿主范围较广，不仅能感染能进行分裂的细胞，也能感染不再分裂的细胞如神经细胞的优点。腺病毒载体不整合进宿主细胞基因组，而是以附加体形式游离在宿主细胞基因组外，这样就避免了病毒载体插入宿主细胞基因组可能引起基因突变等后果，因而使用时更安全。但这同时也造成一些麻烦，由于不整合至宿主细胞基因组，表达外源基因的时间较短(仅数周)，不适合长期表达。因其还有体内的免疫反应和基因容量有限等缺点，限制了腺病毒载体的实际应用和发展。随着人们对于生物分子和免疫因子在体内作用过程的理解逐渐加深，在过去的几年里，人们已经在构建更有效的载体方面取得了大跨步的发展。

Hicks等［4］用腺病毒载体将人IL-2基因转导人骨髓基质细胞，转导后的细胞第10天的表达量最高，达19350pg(或 38IU)IL-2/106细胞/24h，在13天内能检测到IL-2的表达，分泌的IL-2在混合淋巴细胞试验中能促进T淋巴细胞的增殖。Koch等［5］用腺病毒载体将荧光素酶或BMP-2基因转导入人骨髓基质细胞，证实暴露时间是影响腺病毒载体转染骨髓基质细胞毒性的重要因素之一，其暴露时间不应超过4个小时，延长暴露时间会导致细胞死亡增加。Mizuguchi等［6］应用经纤维修饰的腺病毒载体转染骨髓基质细胞，结果超过95%的骨髓基质细胞表达转基因，其转基因活性是传统腺病毒的460倍。

(2)慢病毒栽体:研究表明［7］，以 HIV-1为基础构建的这类慢病毒载体具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫反应小等优点，适于体内基因治疗，因此有望成为理想的基因转移载体。

Zhang等［8］将以HIV-1为基础构建的慢病毒载体携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染骨髓基质细胞获得了较高的转染效率，EGFP表达时间超过5个月，而且慢病毒转染不影响BMSCs传代并分化为其它功能细胞。Lee等［9］应用含CMV、EF1α或PGK启动子的慢病毒载体转染EGFP至胚胎猕猴骨髓基质细胞(rhMSC)，证明含启动子的慢病毒载体可在体外有效转染 rhMSC(转染率:CMV＞EF1α＞PGK)，并且不会抑制rhMSC的分化潜能。McMahon等［10］在实验中比较腺病毒、腺相关病毒、慢病毒及非病毒载体转染骨髓基质细胞的效率及毒性，结果慢病毒的转染率最高，同时细胞毒性很低;腺病毒也有较高的转染率，但随着病毒滴度的升高，细胞死亡率明显升高;腺相关病毒只对兔骨髓基质细胞有效，而对大鼠骨髓基质细胞无效;脂质体有中度的转染率并伴有一定的细胞死亡，电穿孔被证明无效并有很高的细胞死亡率。

虽然慢病毒载体的体外试验令人鼓舞，但体内的表达效率还很低。因此，一方面要进一步提高慢病毒载体在细胞中的表达水平，另一方面要提高动物体内表达效率。

(3)单纯疱疹病毒载体:单纯疱疹病毒载体具有以下优点:①宿主细胞广泛;②病毒滴度高;③外源基因容量大;④对神经细胞具有嗜向性，可在神经元细胞中建立终生潜伏性感染。HSV载体的不足之处在于它的毒性。

Zhao等［11］应用HSV-1载体转染肝细胞生长因子(HGF)至骨髓基质细胞，然后用该骨髓基质细胞治疗脑缺血大鼠，证明移植后一天MSC-HGF治疗组缺血脑组织中HGF蛋白的表达量高于单纯MSC治疗组，并持续至少两周。Ikeda等［12］应用HSV-1载体转染成纤维成长因子-2(FGF-2)至骨髓基质细胞，治疗大鼠局灶性脑缺血，也得到了相似的结果。说明HSV-1载体可将外源基因转染至骨髓基质细胞，并能长期稳定表达。

(4)逆转录病毒载体:逆转录病毒只感染具分裂复制能力的细胞，骨髓基质细胞在体外培养增殖快，使用逆转录病毒转染相对容易。用逆转录病毒转染骨髓基质细胞，转染效率报道不一，从18%到99%不等。Bartholomew等［13］已在体内模型上证实了逆转录病毒介导外源基因转染骨髓基质细胞的可行性。他们将人促红细胞生成素(hEPO)基因转染给狒狒的骨髓基质细胞，可以异体或自体移植。能够在移植后持续137天分泌hEPO，并伴随狒狒体内红细胞容积上升。逆转录病毒载体难以达到高滴度，而且只能转导处于分裂期的靶细胞，因此对骨髓基质细胞的转导效率亦不高，此外由于它可整合至靶细胞染色体的任意位置，因此具有插入突变的潜在危险。基于以上原因，逆转录病毒载体在近年来的基因治疗研究中地位已有所降低。

2.非病毒载体:非病毒载体中最常用的就是阳离子脂质体。阳离子脂质体是一种本身带正电的脂质囊泡，它与带负电的DNA分子稳定结合并能通过细胞的质膜，从而将目的基因传递到细胞内与基因组整合。

张红梅等［14］应用脂质体转染SCF cDNA至骨髓基质细胞，结果转染的骨髓基质细胞SCF mRNA水平表达量高于对照组，其细胞培养上清协同GM-CSF刺激骨髓细胞形成集落数比GM-CSF单独作用高，说明脂质体介导质粒载体转染培养富集的骨髓基质细胞并表达，且转染上清具有生物学活性。杨辉俊等［15］用脂质体转染bFGF基因至骨髓基质细胞，观察到骨髓基质细胞可稳定表达bFGF蛋白至少4周。李兴贵等［16］应用脂质体转染人神经营养因子-4(hNT-4)至骨髓基质细胞，治疗缺氧缺血性脑损伤，应用免疫细胞化学染色和原位杂交分析，证实转染后骨髓基质细胞可以表达hNT-4蛋白和mRNA。由于脂质体载体的转染效率非常低，当前的实验研究中，仅国内有一些研究者应用脂质体载体转染外源基因至骨髓基质细胞，国外很少应用。

为了提高非病毒载体的转染效率，德国Amaxa公司研究出了一种新技术——NucleofectorTM技术，其在世界上第一次实现了非病毒载体与高转染效率的完美结合，特别适用于转染原代细胞和难于转染的细胞系［17，18］。该方法将传统的电穿孔技术和专用的转染试剂结合起来，针对不同的细胞类型，采用一套最理想的转染试剂和转染程序，直接将DNA转染到细胞核内，因而实现了因受到细胞分裂的限制而一直困扰人们的原代细胞的高效率转染。

Nakashima 等［19］和 Aluigi等［20］分别在不同的实验中证明NucleofectorTM技术转染骨髓基质细胞的效率高于其他非病毒载体，Aluigi等［20］还证实NucleofectorTM技术转染白介素-12基因至骨髓基质细胞后，免疫调节细胞因子可持续大量表达至少3周，并且不会破坏它的生物学活性。

NucleofectorTM技术与脂质体等非病毒转染载体相比有很多优点:①前者可以直接将目的基因转染入细胞核;后者是利用脂质体与细胞膜的亲合性先将目的基因转染入细胞浆，然后在细胞分裂时被摄入细胞核。②前者因为结合了电转与转染缓冲液，并在实验室里对特定细胞进行了参数优化;所以其转染率比后者高。③前者转染不依赖于细胞分裂，转染前不需要刺激细胞生长;而且可以成功转染分裂缓慢的细胞如神经元等。而后者转染成功与否及转染率很大程度上依赖于细胞分裂增值活性，转染前需要刺激细胞成长(如转染前1天传代等)，在细胞对数生长期转染才能获得好的效果。④前者还有转染快(电转仅需3秒)、操作简单等优点。NucleofectorTM技术的诸多优点，为基因转染研究以及基因治疗的临床应用提供了一种新的手段。

三、所转染的目的基因

在转基因骨髓基质细胞治疗缺血性脑损伤的实验中，其所携带的目的基因主要分为两类:一种是增加疗效的神经营养因子基因，另一种是使骨髓基质细胞永生化的人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)基因。

1.神经营养因子基因:骨髓基质细胞治疗缺血性脑损伤的主要作用机制之一就是增加神经营养因子的分泌，为了进一步增加其疗效，许多科学家将表达神经营养因子的基因转染至骨髓基质细胞来治疗缺血性脑损伤。Kurozumi等［21］利用一种腺病毒载体分别将BDNF和GDNF基因转染至骨髓基质细胞，然后将基因修饰的骨髓基质细胞移植到一过性大脑中动脉闭塞模型大鼠的缺血侧纹状体中，结果MSC-BDNF和MSC-GDNF治疗组大鼠的神经功能恢复显著优于对照组，脑梗死灶体积显著小于单纯MSC治疗组。Nomura等［22］将BDNF基因修饰的骨髓基质细胞经静脉途径移植到永久大脑中动脉闭塞的大鼠模型中，也得到了与Kurozumi等相似的结果。而 Ikeda［12］和 Zhao［11］等则分别应用 FGF-2 和HGF基因修饰的骨髓基质细胞来治疗脑缺血大鼠也均取得了优于单纯应用MSC的治疗效果。

2.人端粒酶逆转录酶基因:端粒是真核生物染色体末端的特殊结构，在维持染色体的结构和功能方面起重要作用［23］。在每次细胞分裂时，端粒随着细胞有丝分裂而逐渐缩短，所以又被称为“有丝分裂钟”。目前认为:端粒酶在细胞的衰老、死亡及永生化过程中起着重要作用。成人骨髓基质细胞缺乏端粒酶活性，体外培养只能传20代左右，极大地限制了临床研究和应用。导入外源人端粒酶逆转录酶基因可激活细胞端粒酶活性，维持端粒长度［24］。朴明学等［25］将外源性hTERT基因导入成人骨髓基质细胞，结果外源性hTERT基因在DNA、RNA和蛋白质水平均有稳定表达，hMSC-hTERT细胞可稳定传至第82代，其形态与hMSC有明显不同，细胞短小，成三角形或棱形，核仁明显可见，增殖能力强，平均2 d传代1次，冻存、复苏不影响其增殖特性，在一定诱导条件下，永生化的hMSC细胞能够在体外分化成神经元样细胞。Honma等［26］将外源性hTERT基因导入成人骨髓基质细胞，并应用该永生化的骨髓基质细胞治疗一过性大脑中动脉闭塞的大鼠，结果hTERT-MSCs治疗组大鼠脑梗死面积小于对照组，神经功能恢复优于对照组。

3.其他基因:另外，还可以将具有抗凋亡作用的基因如bcl-2基因转染至骨髓基质细胞以提高骨髓基质细胞在体内的存活率。虽然目前还没有此类报道，但已有相似研究的报道。Wang等［27］已经发现，将bcl-2基因制成转基因动物后，其高效表达bcl-2蛋白的骨髓基质细胞经无血清培养基处理后自身的凋亡数量少于正常骨髓基质细胞。因此认为，骨髓基质细胞bcl-2基因高表达可减少骨髓基质细胞的凋亡，推测bcl-2转基因预处理后的个体骨髓基质细胞作为移植供体能提高骨髓基质细胞移植后的成活率。Wei等［28］证实，在体外将bcl-2基因转染到小鼠胚胎干细胞中，可以增加其在脑缺血大鼠脑内的存活与分化，并促进脑缺血大鼠的神经功能恢复。如果将该实验中的胚胎干细胞换成更易于获得的骨髓基质细胞，相信也应该可以得到类似的结果。因此，将具有抗凋亡作用的基因如bcl-2基因转染至骨髓基质细胞来治疗缺血性脑损伤应该是一条可行的途径。

四、问题与展望

尽管骨髓基质细胞在缺血性脑损伤的治疗中显示了巨大的应用价值，但目前还存在一些问题有待解决:(1)还没有找到明确而特异的骨髓基质细胞表面细胞标志物进行鉴别;(2)骨髓基质细胞移植后，其迁移、分化的机制仍不明确;(3)植入体内的骨髓基质细胞能否与宿主神经细胞确实建立神经环路仍属未知，还需要超微结构和电生理方面的研究来证实;(4)移植后只有少量细胞能分化为神经细胞，如何提高其在体内的成活率及向神经细胞分化的能力将是今后研究的一个重要问题。这些问题的解决，将会给缺血性脑血管病的治疗带来一场革命性的进步。

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110000 辽宁大学校医院内科(付霞);中国医科大学附属第一医院神经内科(何志义)