种子染菌成因探析及防治

何鉴清

(江苏江山制药有限公司，江苏靖江 214500)

种子染菌成因探析及防治

何鉴清

(江苏江山制药有限公司，江苏靖江 214500)

种子染菌严重影响发酵生产，会增加生产成本。文章分别从物品灭菌、种子制备环境、无菌操作和设备等几个方面来阐述维生素C菌种在制备过程中的种子带菌原因，操作人员在工作中的注意事项，以及误判为种子带菌等情况，并用实例加以分析说明，提出防治措施，在菌种生产中对避免和防止杂菌污染具有一定指导意义。

发酵；种子；无菌室；操作；染菌；灭菌

维生素C发酵属于液体深层发酵，防止杂菌污染的工作尤为重要。特别是二步种子易被杂菌污染，导致周期延长，产量下降，严重影响发酵生产。科技书上指出：一般种子带菌或怀疑种子带菌占发酵染菌率的9.64%，居发酵污染概率的第三位[1]。怀疑而不能确认是由于确认的手段欠缺，光学镜检不能确认微米生物粒子的污染，种子是否在选育中已被温和性噬菌体污染就更加难以确认。一旦出现种子染菌，要及时组织调查，根据镜检、无检平皿、留样情况，再结合操作人员的回忆分析，找出种子染菌的原因和可能性，采取有效手段弥补一切可能引起种子染菌的漏洞，有针对性地解决问题。

1 种子染菌原因分析及防治

造成种子染菌的原因错综复杂，通过仔细观察和认真分析，归纳出以下几个方面：（1）高温高压蒸汽灭菌不彻底；（2）紫外线灭菌不彻底；（3）无菌室的无菌条件不符合要求；（4）操作不当造成染菌；（5）设备以及其它原因引起的染菌。

1.1 高温高压蒸汽灭菌操作中注意事项

高温高压蒸汽灭菌是利用高压蒸汽产生的高温以及热蒸汽的穿透力，使微生物细胞中的蛋白质极易凝固变性，引起微生物的死亡，从而达到灭菌的目的[2]。

高温高压蒸汽灭菌操作时应注意以下几点：（1）排尽灭菌器中的残留空气及蒸汽管道中的冷凝水，否则压力表所显示的压力是水蒸汽和部分空气压力总和，不是水蒸汽的实际压力，这时温度与压力不成比例，造成灭菌不彻底而且灭菌时间长。（2）在灭菌物品的篓子上粘贴蒸汽灭菌化学指示剂，观察变色是否均匀，来证明灭菌是否彻底。注意化学灭菌指示剂贮存条件为室温20℃，相对湿度50%以下，避免太阳光、荧光灯、紫外灯照射。（3）灭菌完毕后，压力降为“0”时缓缓开门，不然会造成瓶内的液体突然沸腾上升，将塞子顶出或冲湿，这样极易染菌。

实例一：操作人员使用蒸汽灭菌器对固体培养基灭菌后，将分装固体培养基的平皿倒置培养1天后，部分平皿中的培养基上、中、下层都出现细小的白色颗粒，培养二三天后那些白色颗粒处陆续长出杂菌菌落，镜检是阳性芽孢杆菌。经过观察分析，怀疑那白色颗粒是部分琼脂没有化开，8瓶培养基中可能有2-3瓶消不透，说明蒸汽灭菌器内温度达不到规定温度，且热量不均匀。

分析：（1）蒸汽灭菌器内冷空气未排尽；（2）蒸汽灭菌器的冷凝水排水不畅通。

检查：蒸汽灭菌器冷凝水排水管出口在底楼，有人用拖把堵在出汽口造成管道不畅通，拖把清理后，将进入灭菌器前的蒸汽管道内冷凝水排放几分钟，然后开灭菌器进汽阀门，再将灭菌器内冷凝水排放5分钟以上，最后启动灭菌器开始工作。从此再也没有出现上述情况，说明判断正确。

结论：蒸汽灭菌器操作前必须排空蒸汽管道内的冷凝水及冷空气，再对物品进行灭菌，在灭菌过程中温度与压力成比例。一般蒸汽灭菌不彻底易染阳性芽孢杆菌。

1.2 紫外线灭菌

紫外线灭菌是因为紫外线引起细胞内的核酸形成胸腺嘧啶二聚体，从而干扰核酸的复制造成细胞损伤，另外紫外线还可使空气中的氧分子变成臭氧，也有杀菌作用[3]。紫外线对革兰氏阴性菌、噬菌体最敏感，阳性菌次之，但对芽孢杆菌及霉菌孢子不容易杀死。由于紫外线穿透力极低，一般限于对无菌室内空气及物体表面的灭菌。紫外线长期使用后能量逐渐衰减，杀菌效果亦降低，所以，（1）一般紫外灯管照射2000h必须更换新的紫外灯管；（2）部分细菌具有光复活作用，开紫外灯时不要同时开日光灯；（3）因为紫外线不能穿透玻璃，紫外线灯管不能装入照明灯罩（玻璃板）里面。

1.3 无菌室的无菌条件要符合要求

空调净化系统是采用初效、中效、高效过滤器三级过滤，以获得所需的大量无菌空气，来保证无菌室“四度”符合要求，无菌室内的无菌条件必须符合以下几点要求：

（1）无菌室必须符合GMP要求。（2）初效、中效、高效过滤器必须定期更换，每年对高效过滤器做泄漏检查，确保高效过滤器检测合格才能使用。（3）每天要数次巡回检查空气净化系统的温度、湿度、压差等情况。温度控制在20℃-22℃，相对湿度控制在55%-60%，压差≥10Pa为宜。打扫无菌室出风口时一定记住恢复风阀原位，不然无菌室内的压差会发生变化。（4）定期对无菌室的沉降菌、尘埃粒子数、风速、浮游菌等进行环境监测。根据环境监测情况及时做好清洁、灭菌处理工作，确证无菌室的无菌条件都合格。如果监测到有极少量≥5μm尘埃粒子数，说明无菌室卫生打扫不彻底。（5）定期用臭氧消毒器对无菌室内空气消毒，来减少空气中的浮游菌。

实例二：有一次月环境监测各项数据正常，不久操作人员在4#层流罩下制备种液，种液镜检、无检都不染菌，此种液上罐后，小罐终点留样染菌，仔细查找原因发现是由于4#层流罩风速由原4.2m/s下降到2.6m/s（风速标准为大于3.0m/s），维修后未再出现以上问题。

规定：必须不定期测风速，来了解空气的流动速度是否达标。

1.4 操作过程中认真操作及注意点

操作人员首先要树立无菌观念，无菌室只是相对无菌，大自然中有无数尘埃粒子，人是带菌者，必须保持个人卫生，要勤用75%的酒精棉球对双手认真消毒；操作时要一丝不苟，尽量不讲话、减少走动，严格按操作规程操作；要保持瓶壁外无种液培养基及菌液；移种过程塞子不可被培养基蘸湿；操作时碰到不洁物应废弃；发酵现场进行种液移种到小罐时，一定要在火焰范围内操作，这样可减少操作时被杂菌污染的机会，同时要克服麻痹、侥幸心理。

发酵现场消毒工、看罐工若不能正确地操作，都会误导种液的无菌度。如：消毒工在消毒过程中灭菌不彻底以及误将空气过滤器的滤芯消化，看罐工操作时掉零磅、泡沫冒顶等等造成小罐染菌，在不知情的情况下都误判为种子带菌。

实例三：G组的种液镜检，无检平皿，留样，发酵瓶24h、48h样都不染菌，此种液接入218#小罐，小罐终点不染菌（这时菌种室镜检人员发现发酵瓶72h样中有极少量的阳性杆菌，决定对G组种液停止供种），又接入228#中罐，中罐终点不染菌，再接入239#大罐，大罐培养32h时发现有少量的阳性杆菌，直到大罐发酵终点杂菌量不多，（发酵罐内杂菌形态与G组发酵瓶72h染的杂菌形态相同）。

分析：操作过程中有极少量的微生物掉入种液瓶中，不易被留样到，只有通过几次扩大培养才能发现。

实例四：怀疑C组上批种液染菌，禁止上罐。为了赶进度，C组操作人员接种时用G组正在摇床上已培养22小时未做镜检的其中2只摇瓶培养液作为母种接种（侥幸心理认为不染菌）。C组合瓶后镜检正常，种液接入小罐生长正常，再接入中罐，中罐终点发现染少量阴性杆菌，反查小罐终点留样中有极少量阴性杆菌，而G组10桶种液镜检正常上罐后，只有1只中罐培养16小时发现染阴性菌，其余都不染菌。

分析：由于中罐C组、G组染的阴性菌的菌形一样，怀疑G组在无菌室接种过程中可能只有2-3只摇瓶染有极少量阴性菌，恰好是从G组拿到C组的2只摇瓶可能就是其中的1-2只，由于阴性菌的数量极少，逃过了菌种室镜检人员的“眼睛”，C组种液经过冷藏、再扩大培养后，杂菌在小罐培养后期就出现了。

规定：不允许用未经证实是无杂菌的种液作为母种扩大培养。

1.5 如何避免设备及其它原因造成种子染菌

（1）菌种生产设备状况也影响种子无菌度。如：层流罩有漏点；臭氧消毒器失灵；摇瓶机转速过快，冲程过大或摇瓶内液体装得太多，在摇瓶机上摇动时，液体溅到塞子上易引起染菌；恒温培养箱的温控要好，若失灵有时会误判染菌，所以镜检人员要积累生产经验来增强判断能力。（2）发酵现场设备的好坏也会影响种液的无菌度。如：罐体、管道上有沙眼（很难看出）、总空气系统带菌以及不明原因染菌的情况下都误判为种子带菌。（3）菌种生长必须有一个清洁的环境。洁净区域墙壁、地面及设备都必须用消毒剂认真擦洗，空间采用消毒剂喷雾处理。消毒剂每月更换，防止产生耐药菌株。（4）如果分离平皿染菌、茄瓶斜面染菌或种液染菌，立即将所有物品高温灭菌倒入下水道，对所用设备和无菌室必须用消毒剂反复认真擦洗，空间喷雾消毒，并开紫外灯及臭氧灭菌。

2 结语

杂菌无孔不入，因此不能机械地孤立认为某种染菌现象必定是某一原因或渠道所致，应当把染菌的时间、菌形和杂菌存在的环境等方面的情况联系起来加以综合分析，才能作出符合实际的正确判断，从而采取相应的有效措施，制服染菌。总之，只要各级操作人员工作负责，设备完好，种子不带菌，小罐染菌率会降至0。

[1]陈代杰,朱宝泉,等.工业微生物菌种选育与发酵控制技术[M].上海:上海科学技术文献出版社,1994.

[2]林雅兰,罗大珍,等.微生物学[M].北京:北京大学出版社,2011. [3]王宜磊,等.微生物学[M].北京:化学工业出版社,2010.

Cause Analysisand Prevention of BacterialContam ination of Seed

HE Jian-qing
(Aland(Jiangsu)NutraceuticalCo.,Ltd.,JingjiangJiangsu214500,China)

Bacterial contamination of seed affects fermentation production seriously,and canincrease costof production greatly.In this paper,Iw illanalysis the cause ofbacterialcontamination of seed of vitamin C during the preparation process,mattersneeding attention for operators atwork,andm isjudgmentof contaminated seed from some aspects as follows:sterilization,seed preparation environment,aseptic technique and equipment.Then Iw ill illustratemy view w ith some examples and give some advice for controlmeasures.Ithink this paperhave agreatsignificance to avoid and preventbacterial contam ination during the production.

fermentation;seed;sterile room;operating;contam ination;sterilization

Q93

A

1671-0142（2011）05-0076-03

何鉴清（1964-）,女,江苏靖江人,工程师.

（责任编辑 李冠楠）