废旧免疫组化液体石蜡笔的再利用技术

郑燕璇 王晓鸿

免疫组织化学技术是利用免疫学抗体与抗原结合的原理以及细胞化学技术对组织、细胞特定抗原或抗体进行定位定量研究的技术。它广泛应用于生物学、组织解剖学、病理学等[1]。做免疫组化不外乎两种方法:漂片法或贴片法[2]。然而，前者容易烂片，不适合做脑片等大而易碎的组织;后者方法较好，但为了保持良好的染色效果和节省抗体，常常需要免疫组化笔。免疫组化笔无论是国产还是进口，都有在使用过程中液体石蜡流出不畅或使用中用力过大导致液体石蜡流出过多污染片子，免疫组化液体石蜡笔使用到后期隔水性差，同时圈片数量有限，且价格昂贵。我们通过多次实验，摸索出一种废旧免疫组化液体石蜡笔的再利用技术，其防水性好、价格低廉、可保证免疫组化效果。

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验用品和器械 树胶2 ml(中国上海懿洋仪器有限公司)、废旧免疫组化液体石蜡笔一支、30张贴有脑片的载玻片(每张载玻片2张脑片)、0.05 m的PBS、各种抗体、MaxVisionTM试剂盒、DAB显色剂(AEC显色剂)(购于迈新试剂)、湿盒、恒温细胞培养箱、冰箱、普通显微镜等。

1.1.2 实验分组 实验分3组:甲组用美国进口免疫组化笔画圈;乙组用国产一般免疫组化笔(福州迈新公司生产)画圈;丙组用废旧免疫组化液体石蜡笔画圈。每组15张载玻片(30张脑片)。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化笔的制作方法 将废旧免疫组化液体石蜡笔放入二甲苯中，将笔芯中残留的液体石蜡彻底溶解去除干净之后取出，这样就制成了一只再利用免疫组化笔。

1.2.2 免疫组化笔的使用方法 用小瓶倒入2 ml树胶，加入适量二甲苯稀释树胶，将再利用免疫组化笔蘸少量稀释后树胶围绕切片组织周围0.2 cm处画圈，树胶不能覆盖切片上的组织。

1.2.3 免疫组化MaxVisionTM法(试剂盒及抗体均购于福州迈新试剂公司)[3]。①石蜡切片脱蜡和水化后，用 PBS(pH7.4)冲洗3次，3 min次。②根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。③如果有必要(内源性过氧化物酶含量过高的组织)，每张切片加一滴或50 μl 3%过氧化氢，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，3 min/次。④除去PBS液，每张切片加一滴或50 μl的第一抗体(用户自选)，室温下孵育60 min或4℃过夜，建议参见每种抗体的说明书。PBS冲洗3次，3 min/次。⑤除去PBS液，每张切片加一滴或50 μl即用型MaxVisionTM试剂，室温下孵育10～15 min。PBS冲洗3次，3 min/次。⑥除去PBS液，每张切片加2滴或100 μl新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察3～5 min(DAB)或10 min(AEC)。⑦自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝。如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固;如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。

1.2.4 结果观察及统计学处理观察整个实验过程中再利用免疫组化笔的隔水性效果;镜下观察组织切片中抗原与抗体结合后抗原在免疫组化中阳性反应物的表达情况，将所得数据进行统计学处理、分析。

2 结果

2.1 3种免疫组化笔隔水率的比较 美国产免疫组化笔的隔水率为90%;国产免疫组化笔的隔水率为80%;而再利用的免疫组化笔的隔水率可达90%。

2.2 3种免疫组化笔对免疫组化试验阳性结果的影响 镜下大体观察发现:用再利用的免疫组化笔画圈的切片阳性结果良好，而用美国产免疫组化笔画圈的切片虽有阳性结果，但片子周围有时有污染现象。

3 讨论

我们在多次免疫组化实验中发现:市售的各种免疫组化液体石蜡笔有时会出现使用不畅，甚至根本画不出来，有时画片时稍用力过大，液体石蜡就会从笔芯中溢出过多污染切片，是影响免疫组化结果的因素之一，而且此笔价格昂贵，一杆国产笔价格大约在400元左右，画圈不超过200个笔芯中的液体石蜡即用完。为此，我们通过多方探索找到了理想的替代品:中性树胶。树胶是一种天然树脂，广泛应用于生物学、医学，作为生物切片的封藏剂，它可溶于二甲苯、苯、甲苯、二氧氯环等，不溶于水[3]。中性树胶中加入适量二甲苯稀释，可使树胶易浸入笔芯中，在切片上画圈时使之顺畅，同时二甲苯挥发后树胶画的圈淡且薄，但却不影响隔水效果。免疫组化组织切片染色后需用中性树胶封片，封片用的树胶与画圈用的树胶相互溶合，不会形成污染。故此，我们应用其特性再利用了废旧的免疫组化笔，在实验中不但节约了大量的资金，而且使用方便耐用，3 ml树胶可画300个圈左右，代价大约只有2元钱。最重要的是它不影响免疫组化结果，由于隔水性能好，保证了抗原抗体的充分结合，增强了免疫组化的效果，节约各种抗体及试剂盒各试剂，故可推荐使用。

[1]李成文.现代免疫化学技.上海:上海科技出版社，1992:97-100.

[2]朱长庚.神经解剖学.第4版.北京:人民卫生出版社，2002:87.

[3]杜卓民.实用组织学技术.北京:人民卫生出版社，1982:63.