皮肤组织冰冻切片在直接免疫荧光法中包埋剂的改良应用

郑燕璇 王晓鸿 曹婉维 李孜孜 李巍

皮肤疾病中变态反应在其病因发病机制中占很大比重，因此在皮肤活检标本诊断中显示抗原或抗体是很重要的，一般使用冰冻切片直接免疫荧光法观察切片标本上荧光抗体染色结果作为抗原的鉴定和定位。皮肤活检标本冰冻切片行直接免疫荧光法要求切片质量优良，制作一张优质的冰冻切片，制片过程中的每一个环节都很重要，其中包括对包埋剂的选择应用。包埋剂经冷冻后(-20℃ ～-25℃)对皮肤组织可起到支托固定的作用，现大部分医院病理科在制作冰冻切片时常用的包埋剂是OCT，中山大学附属第五医院病理科在多年临床工作中使用普通胶水替代OCT包埋组织(包括皮肤活检标本、肾脏活检标本、手术切除标本等)，所制冰冻切片用于直接免疫荧光检查与使用OCT包埋剂所制冰冻切片用于直接免疫荧光检查效果相同，现介绍如下。

1 资料与方法

1.1 一般材料 皮肤活检标本;普通胶水(用清洁干净的OCT空瓶装载);组织固着器;载玻片;荧光抗体(兔抗人IgA、兔抗人IgG、兔抗人IgM、兔抗人C3)抗体均为丹麦DAKO公司产品;PBS;缓冲甘油等。

1.2 方法 将皮肤活检组织取材后放置在待用的组织固着器正中位置上，用普通胶水替代OCT将组织块完全包埋。在-20℃～-25℃温度中固着器上的组织被包埋剂包裹迅速凝冻固定，将固着器放置到冰冻切片机的冷冻头上(冷冻头设定温度为-15℃左右)。开始修切冷冻头上的组织至组织完全暴露时留片，切片要求尽量薄切，以利于抗原抗体接触和镜检［1］。取出切片用吹风机冷风档吹干固定，将pH7.4的PBS液平铺于切片上浸泡2 min。甩干PBS将稀释好的荧光抗体滴于切片上，在37℃温箱内孵育8～10 min。甩去切片上的荧光抗体，用pH7.4的PBS液平铺浸泡切片2 min。甩去PBS用纸巾擦去组织周边的液体，滴加缓冲甘油封片［2］。

2 结果

用胶水包埋的皮肤活检组织凝冻迅速，质感均匀，易切出完整、连续的组织片，易展片，留片后胶水在玻片上容易用水洗净，同时组织不易脱落。制成免疫荧光片后用荧光显微镜检查(最好即做即看，避免荧光消退，影响诊断结果)，免疫荧光着色不受影响，背景染色、阳性强度及阳性检出率与用OCT包埋剂包埋的冰冻切片制成的免疫荧光片相比较效果无异。

3 讨论

皮肤活检标本的免疫荧光检查对皮肤疾病病理诊断起重要的辅助作用，因此皮肤标本制片的好坏直接影响到检测的结果。在皮肤标本制片过程中应力求保持抗原的完整性，并在染色、洗涤和包埋过程中不发生溶解和变性，也不扩散至邻近细胞或组织间隙中去。冰冻切片的原理是用物理方法低温冰冻被包埋剂包埋的组织块后再切片制片，包埋剂不会破坏抗原的完整性，不会引起抗原发生溶解和变性。用包埋剂将组织块包埋，在低温下迅速凝冻后能对组织块起支托固定的作用，达到容易切片的目的。质量优良的包埋剂(如进口OCT)凝冻时间短，切片时质感滑脆均匀，易切片、展片，易用清水漂洗干净。质量差的包埋剂包埋组织块时凝冻时间长，切片时包埋剂发硬，不易切片及展片，不易用清水漂洗干净，且容易使组织脱落。本科多年来通过反复实验和临床应用后，认为普通胶水代替OCT包埋来制作冰冻切片用于直接免疫荧光检查效果完全与用OCT包埋剂(质量优良的包埋剂)所制切片无异。普通胶水价格便宜，容易购买，进口OCT价格昂贵，同规格型号的产品相比较，后者价格是前者的上百倍。用普通胶水代替质量优良的OCT包埋皮肤活检组织来制作冰冻切片用于直接免疫荧光检查，大大降低了成本，且同样能在短时间内制出质地优良的冰冻切片，此方法值得推广。

［1］王伯沄，李玉松，黄高昇，等.组织切片技术.病理学技术，2000，6(1):76-94.

［2］王伯沄，李玉松，黄高昇，等.肾活检标本的制作技术.病理学技术，2000，6(1):949-952.