血液肿瘤自体造血干细胞移植后患者的DC/CIK培养及临床应用安全性观察

薛重重 杨丽萍 徐新 许红雁 韦湘 温伟英 黄刚

血液肿瘤自体造血干细胞移植后患者的DC/CIK培养及临床应用安全性观察

薛重重 杨丽萍 徐新 许红雁 韦湘 温伟英 黄刚

目的采用自体造血干细胞移植后完全缓解的血液肿瘤患者的外周血单个核细胞，经体外培养扩增出树突状细胞(dendritic cell DC)/细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cell CIK)，应用DC/CIK细胞免疫治疗自体造血干细胞移植后完全缓解血液肿瘤患者，观察其不良反应。方法采集10例血液肿瘤自体造血干细胞移植后完全缓解患者的外周血单个核细胞，在体外经GM-CSF、IL-4、TNF-α等诱导产生DC，经IFN-γ、抗CD3单抗、IL-2等诱导产生CIK，观察其细胞形态及临床应用的不良反应并分析其细胞免疫表型。结果培养产生形态学典型的DC/CIK。诱导成熟的DC经流式细胞仪分析显示CD80、CD83、CD86、CD1a等阳性细胞比率大幅上升。CIK随着培养时间的延长，CD3+CD56+、CD3+CD8+双阳性细胞的比率亦大幅度上升。在DC/CIK细胞免疫治疗过程中，3例患者DC注射部位出现轻微疼痛，可自行缓解。2例患者输注CIK后出现低热，持续时间2～6 h，可自行消退。4例患者输注完CIK后出现乏力，约2 h可自行缓解。结论自体造血干细胞移植后完全缓解患者的外周血单个核细胞对DC/CIK的培养不受影响。DC/CIK细胞免疫治疗自体造血干细胞移植后完全缓解的血液肿瘤患者，安全性好，不良反应少。

细胞免疫治疗;自体造血干细胞移植;血液肿瘤

DC和CIK是肿瘤免疫治疗的两个重要部分，前者识别抗原、激活获得性免疫系统，后者通过发挥自身细胞毒性和分泌细胞因子杀伤肿瘤细胞，二者联合确保了一个高效和谐的免疫体系。将具有强大肿瘤抗原提呈能力的DC和具有高效杀伤活性的CIK联合应用于治疗恶性肿瘤，有助于增强肿瘤患者T细胞免疫能力，起到抗肿瘤作用［1］。基于以上DC/CIK的生物学特性，我们在建立DC/CIK培养体系的基础上，开展了DC/CIK过继细胞免疫治疗血液肿瘤自体造血干细胞移植后缓解患者的临床安全性研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 10例患者为汕头大学医学院附属粤北人民医院血液内科住院并确诊的血液肿瘤自体造血干细胞移植后缓解的患者。男4例，女6例，平均年龄48岁(33～63岁)，其中急性髓细胞白血病(Acute myelocytic leukemia，AML)3例，非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin lymphoma，NHL)5例，多发性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)2例。

1.2 实验材料 COBE Spectra血细胞分离机(美国COBE公司);SANYO MCO-18AICUV CO2培养箱(日本三洋公司);倒置显微镜(广州粤显光学仪器有限责任公司);FACS-Calibuer流式细胞仪(美国Becton-Dickinson公司);RPMI 1640培养基、小鼠抗人CD3单克隆抗体(北京博特纳生物科技有限公司);GM-CSF(辽宁卫星生物制品研究所);IL-4、TNF-α(美国Peppotechinc公司);IFN-γ(上海克隆生物高技术有限公司);IL-2(北京双鹭药业股份有限公司)。

1.3 DC/CIK细胞的培养 在患者签署知情同意书以后，用血细胞分离机采集患者的外周血单个核细胞，经淋巴细胞分离液离心获得单个核细胞，让细胞贴壁生长2 h。将获得患者外周血单个核细胞中的贴壁细胞调细胞密度为5×106/ml进行培养。培养体系:GM-CSF 1000 u/ml、IL-4 500 u/ml、TNF-α500 u/ml，每3 d更换新鲜培养液，诱导培养时间为7～13 d。CIK的体外培养:将获得患者外周血单个核细胞中的悬浮细胞调细胞密度为2×106/ml进行培养。培养体系:CD3单抗50 ng/ml、IFN-γ2000 u/ml、IL-2 1000 u/mll，每3 d 更换新鲜培养液，诱导培养时间为9～13 d。

1.4 DC/CIK细胞的回输 经汕头大学医学院附属粤北人民医院伦理委员会批准，DC/CIK经过质检合格(包括细菌、霉菌培养阴性，细胞活性大于95%等)进行细胞免疫治疗。DC经皮下注射(双颈部、腋下、腹股沟淋巴结区域共6个部位)。CIK经静脉回输。

1.5 DC/CIK细胞免疫表型 DC检测:CD80、CD83、CD86、CD14、CD1a、HLA-DR。CIK 检测:CD3+CD56+、CD3+CD8+、CD3+CD4+。

1.6 不良反应的观察 DC/CIK治疗中密切观察不良反应，如发热、寒战、胸闷、心悸等;治疗过程中所有患者隔日检查一次血常规、大小便常规、肝肾功能及心肌酶等，每周检查一次心电图。

1.7 统计学方法 检测数据以均值±标准差(±s)表示，采用t检验用SPSS17.0软件包进行统计学分析。

2 结果

2.1 DC/CIK细胞培养过程中的质量控制 每例患者的DC/CIK细胞培养过程中均进行多次的细菌、霉菌的检查。结果所有样本检测均为阴性，确保细胞培养及细胞回输的安全。

2.2 不同培养时间DC/CIK免疫表型的变化 10例患者的DC/CIK细胞免疫表型随培养时间的变化而变化，诱导成熟的DC经流式细胞仪分析显示培养第13天，CD80的平均阳性率为94.83%、CD83的平均阳性率为80.84%、CD86的平均阳性率为91.70%、CD1a的平均阳性率为81.52%、HLADR的平均阳性率为95.42%。CIK培养后CD3+CD56+、CD3+CD8+双阳性比率明显升高，培养的第13天平均阳性率分别为48.05%和65.71%，而CD3+CD4+双阳性比率则明显下降。

2.3 不同培养时间DC/CIK细胞形态的变化 DC培养第2天细胞体积开始变大;3 d左右细胞开始出现变形，拉长呈梭形及放射状等各种不规则的形态，部分细胞开始悬浮;培养7 d左右，集落明显增多，有更多的细胞处于轻贴壁状态;培养9 d左右大部分细胞开始悬浮，形态不规则，镜下可见大量具有毛刺状突起的细胞，为典型的DC形态。CIK培养第5天左右开始倍增，细胞体积明显增大，呈现母细胞化，并成簇生长;在培养的第7天，细胞数量明显增多，细胞团更大，悬浮在培养液中。

2.4 DC/CIK细胞治疗的不良反应 DC皮下注射过程中、CIK回输后4例患者无不适，3例患者DC注射部位有轻微疼痛，10～15 min后可自行缓解。CIK回输后1例患者出现低热、乏力症状，1 h后缓解，1例患者出现低热持续2 h左右，可自行缓解，3例患者出现乏力1 h后可自行缓解，所有患者回输中及回输后均未出现寒战、胸闷等不适，亦未出现皮疹等过敏反应。在治疗过程中，患者一般情况良好，无肝肾功能损害，心肺功能亦无影响。

3 讨论

DC和CIK是肿瘤免疫治疗的两个重要部分，将DC与CIK联合起来治疗血液肿瘤，将有助于解除部分肿瘤患者T细胞的免疫能力，从而发挥协同抗肿瘤作用。

未成熟DC在外周组织捕获抗原后，需经引流淋巴管迁移至局部淋巴结，在淋巴结T细胞区与初始型T细胞接触并活化初始型T细胞，因此，DC的输注途径可能决定了细胞免疫能否发生及发生的强弱。动物实验表明，皮下和皮内注射DC比静脉注射更易诱导细胞毒性T淋巴细胞反应［2］。Fong等［3］将体外至敏的DC分别采取皮内、淋巴管及静脉三种不同的途径输入前列腺癌患者体内，研究发现三种途径虽然均能诱导抗原特异性T细胞免疫应答，但反应程度各不相同。经皮内和淋巴管途径能产生高水平的TNF-γ，更易诱导Th1应答。目前认为静脉注射有利于DC在体内的分布，但也可能大部分被肝脏清除和抑制，皮下淋巴结区域注射有利于DC和T细胞的接触。岳欣等［4］研究不同输注途径对CIK治疗后的体内分布的影响，动物实验表明CIK输入体内后，迅速分布至肝、脾、肾、肺、胃、肠等器官，其中肝、脾、肾的分布浓度最高，CIK输入体内的早期，尾静脉注射途径中肺最先达到分布高峰，而腹腔注射途径中腹腔内器官率先达到分布高峰。研究表明，CIK体内分布的广泛性表明它可以用于身体各部位恶性肿瘤的治疗，而血管输入途径可能更适于血供丰富器官肿瘤的治疗，而体腔输入途径也许更适合于体腔内恶性渗液或局限病灶的治疗。

到目前为止未见DC应用于肿瘤的临床免疫治疗出现明显的不良反应报道。Reichart等［5］对12例HSCT后多发性骨髓瘤患者使用Id致敏的DC进行免疫治疗，所有患者治疗过程中及治疗后无明显毒副反应，治疗后2例CR患者产生了Id特异性的T细胞增生性免疫反应并且一直保持CR，其中1例HSCT无效的患者未经进一步化疗，只接受DC免疫治疗，目前仍存活达20个月。张乐萍等［6］临床应用CIK与IL-2联合治疗儿童ALL微小残留病灶(MRD)，结果显示:14例患者应用CIK/IL-2治疗，输注过程中无1例出现寒战、发热、过敏。对心肺功能影响不大;输注后外周血白细胞略有升高，血红蛋白和血小板无变化，说明CIK具有安全性。治疗组随访5～33个月无1例复发，生存时间超过30～54个月，且骨髓形态学和MRD检测均为阴性。对照组8例复发死亡，两组复发率比较差异有统计学意义。石永进等［7］应用自体CIK对5名恶性血液系统肿瘤患者进行治疗，回输时患者未出现明显毒副反应，回输后行心、肝、肾等器官功能检测未出现新的异常。随访22～26个月，其中APL患者CIK治疗前PML-RARα融合基因为阳性，CIK回输后转为阴性，2年后检查仍为阴性;除AML M4患者复发外，其他患者均正常，未见复发。

基于以上肿瘤细胞过继免疫治疗的研究进展，我们开展DC/CIK过继细胞免疫治疗自体造血干细胞移植后完全缓解血液肿瘤的临床安全性研究，观察其治疗过程中及治疗后的不良反应。临床研究在DC/CIK在治疗过程中及治疗后主要的不良反应是低热、疲乏无力、注射部位轻微疼痛等。低热多发生在输注完2 h左右，持续2～6 h左右，可自行缓解，疼痛亦可自行缓解。DC/CIK治疗后患者的外周血、肝肾功能、心肌酶等血液生化指标不受治疗影响。在治疗过程中观察患者生命体征平稳，无危及生命的并发症出现。未见食欲减退等症状，患者精神状态较好。DC/CIK治疗不良反应少，临床治疗是安全的。

［1］ 隋承光，孟凡东，王晓华，等.CIK的制作及对不同肿瘤细胞株体外抗肿瘤作用的研究.中国医科大学学报，2005，34(3):210.

［2］ Jonathan S.Serody，Edward J.Collins，Roland M.Tisch，et al.T Cell Activity After Dendritic Cell Vaccination Is Dependent on Both the Type of Antigen and the Mode of Delivery.The Journal of Immunology，2000，164:4961-4967.

［3］ Lawrence Fong，Dirk Brockstedt，Claudia Benike，et al.Dendritic Cell-Based Xenoantigen Vaccination for Prostate Cancer Immunotherapy.The Journal of Immunology，2001，167:7150-7156.

［4］ 岳欣，李慧，于津浦，等.不同输注途径对CIK细胞治疗后的体内分布的影响.中国免疫学杂志，2007，23(3):224-228.

［5］ Reichart V L，Okada C Y，Liso A，et al.Idiotype vaccination using dendritic autologous periphereal blood stem cell transplantion for multipe myeloma a feasibility study.Blood，1999，9397:2411-2419.

［6］ 张乐萍，陆爱东，童春容，等.细胞因子诱导的杀伤细胞/白细胞介素2治疗儿童急性淋巴细胞白血病微小残留病灶疗效观察.实用儿科临床杂志，2003，18(3):185-186.

［7］ 石永进，虞积仁，朱平，等.细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞的大容量扩增与杀伤活性观察.生物医学工程学杂志，2001，18(1):94-96.

512026汕头大学医学院附属粤北人民医院