奶牛乳腺炎抗性候选基因多态性研究进展

魏 伟，苗永旺

（云南农业大学动物科学技术学院，云南 昆明650201）

随着人们生活水平的提高，奶制品以及加工工艺对原料奶质量要求的提高，使得在使用抗生素治疗奶牛乳腺炎时造成牛奶中抗生素残留问题越来越突出；另外，随着奶牛向高产奶量方向选育，奶牛乳腺炎发病率也越来越高。因此，如何通过药物预防和治疗奶牛乳腺炎，如何减少牛奶中药物残留等方面，这些并不能从根本上解决奶牛乳腺炎发病率高的问题。而对奶牛乳腺炎抗性候选基因的研究，选育出抗乳腺炎奶牛品种，这才是降低奶牛乳腺炎发病率的根本所在［1］。

乳腺炎（mastitis）是一种在奶牛业中多发的并且极其复杂的疾病，想通过一种单一方法去防治奶牛乳腺炎，效果并不理想。现在乳腺炎仍然是奶牛群中花费最多的一种疾病，在美国将近要花费20亿美元用来预防乳腺炎和提高奶产品的质量，日本将进花费690亿日元［2］。Shook［3］报道，奶牛乳腺炎遗传力仅为0.02～0.04。可见其遗传力较低，因此，对奶牛乳腺炎性状进行直接选择的标准性很小。近年来，随着是基因组学和生物信息学迅速发展，为乳腺炎抗病育种提供了新方法，尤其是现在基因芯片的广泛使用及不同组织器官转录组深入研究，为奶牛乳腺炎抗病育种提供了新的前景。本文就奶牛乳腺炎抗性候选基因研究进展作一综述。

1 牛锌指蛋白313（Znf313）基因

锌指蛋白基因家族是一个巨大的超基因家族。锌指蛋白是一类具有手指状结构域的转录因子，在基因的表达调控、细胞分化等方面起重要的作用。

Znf313基因是锌指蛋白家族的成员，参与基因表达调控。曹随忠等［4］利用一个患乳腺炎奶牛外周血白细胞中差异表达的EST序列，采用了电子克隆和分子生物学实验技术相结合的方法，克隆了一个与奶牛乳腺炎抗性相关的基因cDNA编码序列，并将该基因被命名为锌指蛋白313基因，其开放阅读框架1～639bp，推测其编码230个氨基酸。他们还将克隆的Znf313基因推测的编码氨基酸序列与人和猪的Znf313基因编码氨基酸序列进行比较，相似性为95%和94%，揭示牛Znf313基因与人和猪Znf313基因具有相似的生物学功能。Ma等［5］克隆了人Znf313基因并研究了其生物学功能，结果表明人Znf313基因参与细胞分化。该基因在水牛上还没有相关的报道，有待于进一步研究。

2 前脑锌指蛋白基因

前脑锌指蛋白（forebrain embryonic zinc finger－like，FEZL）是锌指蛋白基因家族中的成员，作为转录因子在动物的神经发育中起重要的作用，主要调控单胺能（monoaminergic）的神经细胞的发育和机体的先天性免疫。

Sugimoto等［2］研究证明奶牛乳腺炎能够诱发乳腺中FEZL的表达，而FEZL能促进SEMA5A的表达。SEMA5A表达量的提高能够诱发与宿主免疫反应相关的至少九个基因的表达，包括TNF－α和IL－8。通过测序对比，易感乳腺炎型个体的FEZL序列与抗乳腺炎型个体的FEZL基因序列差异只是存在一个三个碱基的插入突变，导致FEZL氨基乙酸链长由12变成13。因为FEZL氨基乙酸链的长度影响它的转录活性，从而控制细胞因子的表达。随后Sugimoto等［6］研究发现通过育种值估计来评价体细胞评分（somatic cell score，SCS），携带杂合12G的公畜的SCS明显要低于携带纯合的13G公畜，因此选择携带杂合12G的公畜可以减少乳腺炎的发病率。该基因在黄牛上有研究，水牛上还没有相关报道。

3 TLR4基因

TLR4（toll－like receptor 4）是 TLRs（toll－like receptors）家族的重要成员之一，属于I型跨膜蛋白，该蛋白胞外区高度变异，以适应不同配体分子的需要，胞内区却很保守，以便维持信号转导活性的需要［7］。牛 TLR4基因位于牛的8号染色体上［8］，全长11Kb，在机体炎症反应启动和病原微生物的免疫应答中发挥着重要的作用。

王兴平等［9］采用 CRS－PCR（create restricti on site combined with restriction fragment length polymorphism）方法扩增了奶牛TLR4基因第三外显子243bp的目的片段，通过限制性内切酶Hinf I酶切筛查多态位点，发现扩增产物27bp处C－T突变造成编码氨基酸由苏氨酸变为异亮氨酸，结果表明AA基因型为乳腺炎抗性基因型，A等位基因为乳腺炎抗性有利基因。刘文娇等［10］采用PCR－RFLP（polymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism）方法对奶牛TLR4基因第三外显子321bp的部分序列进行多态性分析，通过限制性内切酶Bbv12I酶切筛查多态位点，C－T突变导致编码氨基酸由苏氨酸变为异亮氨酸，结果表明不同基因型奶牛的SCS表现出CC基因型＞CT基因型＞TT基因型的趋势。该基因在水牛上有相关的研究，但只有该基因的核苷酸序列。

4 TLR2基因

TLR2（toll－like receptor 2）是 TLRs家族中的第2个成员，能够识别多种病原微生物及其产物，介导天然免疫，通过细胞内信号转导，启动获得性免疫。牛TLR2基因被定位在17号染色体上［8］。

Petzl等［11］对14头未感染乳腺炎的奶牛乳腺接种大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，通过实时定量PCR（Real－time Quantity PCR）检测，发现大肠杆菌侵染后可显著增加TLR2、TLR4以及β－防御素（β－defensin）的表达，而接种金黄色葡萄球菌后可显著增加β－防御素的表达。白杰等［12］对TLR2基因编码区进行测序，在第二外显子发现3个SNPs，然后对这3个SNPs进行PCR－RFLP检测，结果揭示189、631位点的SNP对奶牛的SCS有较大影响，而2260位点的SNP可能会提高奶牛的SCS。

5 乳铁蛋白基因

乳铁蛋白（lactoferrin，Lf）是保护乳腺组织的防御因子之一，属于转铁蛋白家族［13］，具有广谱的抗菌作用。编码乳铁蛋白的基因被定位在22号染色体上，而且乳铁蛋白浓度能被遗传（h2＝0.4）［14］，其含量和乳腺炎的发生存在相关性，并发现在复原的乳腺组织内Lf能极大地阻止葡萄球菌和大肠杆菌生长。

Diarra［15］认 为，N－乙 酰－β－D－氨 基 葡 萄 糖 苷 酶（N－acetyl－β－D－glucosaminidase，NAGase）不仅仅可以作为乳腺炎检测的一个指标，而且该酶还具有一定的免疫活性，通过与Lf协同作用，能够抑制某些病原微生物的活性。因此，从生理作用、蛋白质结构到表达等各个水平深人研究NAGase在乳腺炎发生中的作用，对研究奶牛乳腺炎的检测、治疗乃至乳腺炎抗性的遗传选育等都具有重大意义。王洪梅等［16］采用 PCR－RFLP、CRS－PCR 方法研究了中国荷斯坦牛Lf基因的启动子区，结果表明Lf基因启动子区72位的AB基因型和478位的CC基因型均是奶牛乳腺炎抗性的优良基因型，可作为分子标记应用于奶牛乳腺炎抗性筛选。

6 趋化因子受体基因

趋化因子（chemokine）是指一类能够趋化细胞定向移动的小分子分泌蛋白。趋化因子受体属于G蛋白偶联7次跨膜受体家族［17］，大小一般由350～360个氨基酸组成。趋化因子通过与受体的结合，对免疫细胞在体内的迁移、活化和分布起重要作用，并参与免疫应答的调控，与机体抵抗感染（如HIV感染）等密切相关。

牛CXCR1基因被定位在2号染色体距着丝粒约90.3cM 处，其 mRNA 全长是1083bp［18］。陈仁金等［18］采用PCR－SSCP方法研究了CXCR1基因的5＇侧翼区和编码区进行多态性检测，研究结果发现1830（A/G）位点AA基因型、1768（T/A）位点TT基因型和344（T/C）位点TT基因型以及根据发现的4个SNPs预测的10种单倍型中单倍型Haplo2（ATTA）纯合体对中国荷斯坦牛的SCS具有较大的遗传效应，可作为分子标记应用于奶牛乳腺炎抗性的筛选。

当牛乳房发炎时，嗜中性粒细胞将从血液中迁移到病菌感染处，通过与其受体结合吞噬病原体。研究表明，CXCR2基因多态性与牛的临床和亚临床性乳腺炎对疾病敏感性相关［19］。Younggerman等［20］研究了CXCR2基因的777位的SNP与乳腺炎抗性之间的关系，777位SNP基因型和隐性乳腺炎的表达显著相关。刘文娇等［21］采用测序技术对CXCR2基因编码区进行了多态性筛查，结果发现在612位、684位、777位、855位、858位和861位有6个SNPs，其中612位和777位SNPs可作为奶牛乳腺炎抗性分子标记位点。该基因在水牛上没有相关研究报道。

7 热休克蛋白70

热休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）作为蛋白成熟过程中的分子伴侣通过分子伴侣作用参与新生蛋白质折叠、转运、损伤蛋白质的修复和抗原呈递等许多重要体内过程，其表达能够减少NO的合成释放，减轻炎症因子对细胞的损伤。牛的HSP70由HSP70－1和 HSP70－2这两个基因编码，都被定位在染色体23q13。程维杰等［22］采用PCRSSCP和PCR－RFLP方法研究了中国荷斯坦奶牛HSP70－1基因编码区的多态性及其与中国荷斯坦牛SCS的相关性，研究发现1623位点和2409位点2个SNPs，1623位点基因型与SCS相关性显著（P＜0.05），2409位点基因型与SCS相关性不显著（P＞0.05），CC基因型可作为改良奶牛乳腺炎抗性性状的分子遗传标记。该基因在水牛上也没有相关研究报道。

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