胰腺癌干细胞研究现状

刘俊 董维平

胰腺癌是恶性程度非常高、预后非常差的消化道肿瘤之一。大部分患者发现时已属无法手术切除的晚期胰腺癌，并对放化疗不敏感。最近的研究表明胰腺癌干细胞是胰腺癌发生和进展的源头，并对放疗和化疗导致的凋亡耐受，对胰腺癌干细胞自我更新和耐药机制的深入研究可能发现对胰腺癌更有效的治疗措施。现对胰腺癌干细胞研究现状作一综述。

一、胰腺癌干细胞的分离鉴定

现有的方法主要应用细胞表面标志物来筛选，主要的干细胞标志物有CD44+CD24+ESA+、CD133+和ABCG2+等。然后检测筛选出的细胞是否表现干细胞自我更新和增殖分化的特性来判断是不是胰腺癌干细胞，使用的细胞主要有胰腺癌新鲜标本和胰腺癌细胞株。

Li等[1]2007年应用胰腺癌新鲜标本进行裸鼠皮下种植等办法，获得大量胰腺癌细胞，并提取鉴定了高肿瘤生成性的胰腺癌细胞亚群CD44+CD24+ESA+细胞，发现仅注射100个CD44+CD24+ESA+胰腺癌细胞就有50﹪的成瘤性，而CD44－CD24－ESA－细胞只有注射104个才有成瘤性，且成瘤率只有8.3﹪。同时发现分离出来的CD44+CD24+ESA+细胞形成的移植瘤传代后，其肿瘤组织中CD44、CD24和ESA表达阳性细胞的比例仍与其来源的人胰腺癌组织相似。CD44+CD24+ESA+胰腺癌细胞具有干细胞样的高成瘤性、自我更新能力和分化成不同种类细胞的特性，因此认为成功地分离鉴定了胰腺癌干细胞。但细胞周期分析这些不同亚群细胞增殖率没有差别，因此有学者认为这些细胞不是肿瘤起源母细胞产生的后代，而可能是细胞对外界因素刺激而改变了表面标志物。Huang 等[2]应用流式细胞仪在胰腺癌细胞株Panc-1中分选出CD44+CD24+细胞，发现CD44+CD24+细胞在体外其增殖率低于CD44－CD24－细胞，但成瘤率却高20倍，认为Panc-1中的CD44+CD24+细胞有肿瘤干细胞的特性。

另外Hermann等[3]使用磁珠从胰腺癌标本和胰腺癌细胞株L3.6pl中均分选出CD133+的胰腺癌细胞，发现CD133+细胞也具有高成瘤性、自我更新和多向分化的干细胞特性，细胞周期分析CD133+细胞分裂要明显慢于CD133-细胞，认为CD133+细胞可能是胰腺癌干细胞。研究发现，CD44+CD24+ESA+胰腺癌细胞和CD133+细胞存在部分交叉，是否同时应用这两种标记物进一步的限定细胞亚群，是否会得到致瘤性更强的亚群值得进一步的研究。Maeda等[4]应用免疫组化法分析80例胰腺癌组织标本中CD133的表达，发现CD133阳性表达与淋巴结转移、VEGF-C表达以及预后差有关，提示CD133阳性细胞在胰腺癌的发生发展中起重要作用。而Welsch等[5]应用免疫组化方法检测15对原发性/复发性胰腺癌中CD133、CXCR4和actinin-4的表达，发现CD133在正常和炎性损伤的导管顶膜上表达，而在胰腺导管癌细胞膜上未见表达，仅极少胰腺导管癌细胞浆中表达CD133，因此对CD133作为胰腺癌干细胞特异性标志物提出了异议。

还有其他对胰腺癌干细胞的分离鉴定研究。Olempska等[6]检测了5个胰腺癌细胞株中肿瘤干细胞标志物的表达，发现ABCG2在5株细胞株中均存在表达，且胰腺癌细胞株Panc-1中的ABCG2+细胞具有类干细胞SP（Side Population）特性，因此认为ABCG2阳性可能代表胰腺癌干细胞。Wang等[7]从Panc-1细胞株中分离出的SP细胞高表达CD133和ABCG2，具有很高的成瘤性和分化成非SP细胞的能力，因此认为从Panc-1细胞株中分离出的SP细胞中富含胰腺癌干细胞。Dembinski等[8]从胰腺癌细胞株BxPC-3和Panc03.27中分离出慢周期细胞亚群（DiI+/SCC），这些能保留亲脂性标记染料DiI细胞只有部分与干细胞标记物CD24+/CD44+,CD133+和ALDH的细胞交叉重叠，但DiI+/SCC细胞对化疗耐药并能重建异质性的肿瘤细胞群，因此DiI+/SCC细胞可能也富含胰腺癌干细胞。

二、胰腺癌干细胞与转移

胰腺癌干细胞与胰腺癌的转移有关。上皮细胞-间充质转化(epithelial- mesenchymal transition,EMT)是侵袭转移的标志，Hermann等[3]研究发现CD133+胰腺癌细胞的EMT指标细胞角蛋白表达缺失，而CD133-细胞则细胞角蛋白表达阳性，提示胰腺癌干细胞与侵袭转移有关。最近报道提示当高肿瘤生成性的癌细胞发生EMT时开始表达干细胞标志物，提示CD133+胰腺癌细胞可能正在经历EMT[9]。Dembinski等[8]分离的DiI+/SCC细胞表现为EMT，同时伴有Hedgehog/TGFβ通路的选择性上调和EGFR的下调，与非标记的快周期细胞相比其侵袭能力明显增加，提示胰腺癌干细胞可能通过EMT而侵袭力增加。另外Hermann等[3]进一步研究发现胰腺癌干细胞CD133+CXCR4+和CDl33+CXCR4－均有成瘤性，但是只有CD133+CXCR4+细胞有转移能力，且CXCR4抑制剂能抑制其转移能力，提示胰腺癌干细胞的转移能力可能与CXCR4相关。

三、胰腺癌干细胞与胰腺癌耐药

越来越多的证据表明胰腺癌干细胞与胰腺癌耐药有关。Shah等[10]的研究发现用治疗剂量的吉西他滨干预胰腺癌细胞株L3.6p和AsPC-1后，耐药细胞中与肿瘤干细胞相关的细胞表面标志物CD44、CD24和ESA的表达呈上升趋势，同时细胞呈EMT表现，即应用吉西他滨后杀灭敏感的胰腺癌细胞而胰腺癌干细胞表现出富集。Hong等[11]进一步用HPAC和CRPAC-1建立吉西他滨耐药细胞株，发现耐吉西他滨细胞株中CD44+细胞明显增加，表现出强的成瘤性和球体形成能力，且CD44+细胞能重建耐药细胞群。Lee等[12]研究发现放疗和吉西他滨干预CD44+CD24+ESA+胰腺癌干细胞皮下移植瘤模型后，不仅没有抑制肿瘤生长，反而表现出刺激肿瘤生长。上述研究提示表达CD44+CD24+ESA+的胰腺癌干细胞对吉西他滨耐药。另外Hermann等[3]发现CD133+胰腺癌干细胞在体外和体内实验中均对吉西他滨明显耐药。Wang等[7]从Panc-1细胞株中分离出的SP细胞表现很高的体内外耐药。

此外，Hong等[11]进一步探讨了胰腺癌干细胞耐药的机制，研究发现耐吉西他滨HPAC和CRPAC-1细胞株CD44+细胞增加的同时，对docetaxel也耐药，导致获得性耐药的重要因子MDR1明显增加，应用MDR1拮抗剂能明显增加胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性，提示MDR1可能是胰腺癌干细胞耐药的重要机制。

四、胰腺癌干细胞与信号通路

胰腺癌干细胞的信号通路研究主要集中在自我更新相关的通路上,这些通路亦与肿瘤的发生有关。与自我更新相关的通路有hedgehog、BMI-1、Wnt/β-catenin和Notch通路等。Hedgehog通路主要参与细胞的自我更新和分化，在正常分化的成人胰腺上没有特异性的Hedgehog表达。2003年Berman等[13]发现Hedgehog通路在胰腺癌的发生上起重要作用，应用Hedgehog通路阻滞剂Cyclopamine能显著抑制胰腺癌细胞株在小鼠上的生长和明显减少胰腺癌细胞的增殖细胞比例。Bailey等[14]研究发现高表达Sonic Hedgehog (Shh)能显著增加移植瘤的体积和转移能力，应用Shh中和抗体5E1能减少移植瘤的大小和转移。Li等[1]发现CD44+CD24+ESA+胰腺癌细胞中的Shh mRNA的表达与CD44－CD24－ESA－细胞相比升高了4倍，与正常胰腺细胞相比升高了46倍。Lee等[15]研究也发现Shh发现在CD44+CD24+ESA+胰腺癌细胞中存在明显高表达，提示胰腺癌干细胞存在Hedgehog信号通路异常。BMI-1主要通过促进细胞周期的进行而控制增殖，与很多肿瘤的自我更新有关。Martínez-Romero等[16]发现BMI-1在发育早期以及胰岛细胞、胰腺导管上表达而在成人的胰腺腺泡上不表达，但在胰腺导管上皮内瘤（PanIN）和胰腺导管癌中表达，提示BMI-1与胰腺癌的发生有关。Lee等[15]研究发现BMI-1 mRNA在胰腺癌干细胞（CD44+CD24+ESA+）中明显高表达，提示BMI-1可能在胰腺癌干细胞自我更新的维持上起作用。Wnt/β-catenin和Notch通路与很多肿瘤的发生有关，也与很多干细胞的自我更新和分化有关。Pasca di Magliano等[17]在人胰腺癌标本和鼠胰腺癌模型中发现Wnt的胰腺激活，抑制胰腺癌细胞株的Wnt激活能明显减少增殖，增加凋亡。Wang等[7]从Panc-1细胞株中分离出的SP细胞表达明显高的Notch1 mRNA水平。Katoh等[18]发现wnt依赖的Notch信号激活因子JAG1在胰腺癌中表达，提示wnt、Notch等信号通路异常可能与胰腺癌干细胞的自稳态有关，但胰腺癌干细胞与Wnt/β-catenin和Notch通路异常的关系尚需要进一步的研究。

五、胰腺癌干细胞与胰腺癌的治疗研究

胰腺癌干细胞的研究改变胰腺癌的临床治疗策略。胰腺癌干细胞比普通胰腺癌细胞更能耐受放疗和化疗，使治疗失败，这可能是目前临床治疗胰腺癌失败的原因。因此，胰腺癌的治疗应是针对胰腺癌干细胞的治疗。靶向性杀伤胰腺癌干细胞使根治胰腺癌和防止其复发和转移成为可能，至少针对胰腺癌干细胞的治疗效果可能更持久，这对于胰腺癌的治疗有深远的意义。Salnikov等[19]应用针对肿瘤干细胞标志物上皮黏附分子(EpCAM)的双特异性抗体EpCAMxCD3能明显地延缓胰腺癌细胞株BxPC-3移植瘤在SCID鼠上的生长，Mueller等[20]最新研究发现联合应用针对Hedgehog和mTOR信号通路的抑制剂和化疗能显著清除体内外实验中的胰腺癌干细胞，使用三联疗法的小鼠能显著耐受人胰腺癌细胞的移植，生存期明显延长。上述研究提示针对胰腺癌干细胞的治疗有重要的临床意义。

六、小结和展望

胰腺癌干细胞的研究是目前胰腺癌研究的热点和方向，主要集中在分离鉴定胰腺癌干细胞和其与侵袭转移、耐药和信号通路等方面的研究。已在胰腺癌中证实胰腺癌干细胞的存在，并进行了分离鉴定工作，但仍存在争议。随后研究发现胰腺癌干细胞与胰腺癌的转移及耐药有关，有信号通路异常的表现，并对胰腺癌干细胞治疗进行了尝试性研究。但目前的研究仍是冰山的一角，有太多的问题需要研究解决：（1）胰腺癌干细胞有关的自我更新、分化等相关的机制问题；（2）信号通路异常在胰腺癌干细胞中的作用问题；（3）胰腺癌干细胞在胰腺癌发生、发展以及耐药中的作用；（4）针对胰腺癌干细胞靶向治疗的药物的筛选等。随着胰腺癌干细胞研究的深入，可能找到根本改变胰腺癌治疗方式的措施。

1 Li C,Heidt DG,Dalerba P,et al.Identification of pancreatic cancer stem cells[J].Cancer Res,2007,67(3):1030-1037.

2 Huang P,Wang CY,Gou SM,et al.Isolation and biological analysis of tumor stem cells from pancreatic adenocarcinoma[J].World J Gastroenterol,2008,14(24):3903-3907.

3 Hermann PC,Huber SL,Herrler T,et al.Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer[J].Cell Stem Cell,2007,1(3):313-323.

4 Maeda S,Shinchi H,Kurahara H,et al.CD133 expression is correlated with lymph node metastasis and vascular endothelial growth factor-C expression in pancreatic cancer[J].Br J Cancer,2008,98(8):1389-1397.

5 Welsch T,Keleg S,Bergmann F,et al.Comparative analysis of tumorbiology and CD133 positivity in primary and recurrent pancreatic ductal adenocarcinoma[J].Clin Exp Metastasis,2009,26(7):701-711.

6 Olempska M,Eisenach PA,Ammerpohl O,et al.Detection of tumor stem cell markers in pancreatic carcinoma cell lines[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2007,6(1):92-97.

7 Wang YH,Li F,Luo B,et al.A side population of cells from a human pancreatic carcinoma cell line harbors cancer stem cell characteristics[J].Neoplasma,2009,56(5):371-378.

8 Dembinski JL,Krauss S.Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma[J].Clin Exp Metastasis,2009,26(7):611-623.

9 Mani SA,Guo W,Liao MJ,et al.The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells[J].Cell,2008,133(4):704-715.

10 Shah AN,Summy JM,Zhang J,et al.Development and characterization of gemcitabine-resistant pancreatic tumor cells[J].Ann Surg Oncol,2007,14(12):3629-3637.

11 Hong SP,Wen J,Bang S,et al.CD44-positive cells are responsible for gemcitabine resistance in pancreatic cancer cells[J].Int J Cancer,2009,125(10):2323-2331.

12 Lee CJ,Dosch J,Simeone DM.Pancreatic cancer stem cells [J].J Clin Oncol,2008,26(17):2806-2812.

13 Berman DM,Karhadkar SS,Maitra A,et al.Widespread requirement for Hedgehog ligand stimulation in growth of digestive tract tumours [J].Nature,2003,425(6960):846-851.

14 Bailey JM,Mohr AM,Hollingsworth MA.Sonic hedgehog paracrine signaling regulates metastasis and lymphangiogenesis in pancreatic cancer [J].Oncogene,2009,28(40):3513-3525.

15 Lee CJ,Li C,Simeone DM.Human pancreatic cancer stem cells: implications for how we treat pancreatic cancer[J].Transl Oncol,2008,1(1):14-18.

16 Martínez-Romero C,Rooman I,Skoudy A,et al.The epigenetic regulators Bmi1 and Ring1B are differentially regulated in pancreatitis and pancreatic ductal adenocarcinoma [J].J Pathol,2009,219(2):205-213.

17 Pasca di Magliano M,Biankin AV,Heiser PW,et al.Common activation of canonical Wnt signaling in pancreatic adenocarcinoma [J].PLoS One,2007,2(11):e1155.

18 Katoh M,Katoh M,Notch ligand,JAG1,is evolutionarily conserved target of canonical WNT signaling pathway in progenitor cells [J].Int J Mol Med,2006,17(4):681-685.

19 Salnikov AV,Groth A,Apel A,et al.Targeting of cancer stem cell marker EpCAM by bispecific antibody EpCAMxCD3 inhibits pancreatic carcinoma [J].J Cell Mol Med,2009,13(9B):4023-4033.

20 Mueller MT,Hermann PC,Witthauer J,et al.Combined targeted treatment to eliminate tumorigenic cancer stem cells in human pancreatic cancer [J] .Gastroenterology,2009,137(3):1102-1113.