肝癌干细胞的研究进展

葛丽丽 综述;杨小昂 审校

(郑州大学河南省医药科学研究院，河南郑州450052)

肝癌干细胞的研究进展

葛丽丽 综述;杨小昂 审校

(郑州大学河南省医药科学研究院，河南郑州450052)

肝癌;干细胞;标志物

肝癌是一种常见的恶性肿瘤，主要分布于亚洲东南部和撒哈拉沙漠以南的非洲地区，近25年，美国和欧洲地区发病率也在持续增加。肝癌的死亡率仅次于肺癌和结肠癌排名世界第三。预计未来20年，其发病率和死亡率还会成倍上升［1－2］。然而目前肝癌的发病机制仍不明确，寻找其有效靶点，探明发病机制迫在眉睫。随着研究的深入，在越来越多的肿瘤中发现肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)的存在［3－5］，以此推测在肝癌中可能也存在肝癌干细胞(liver cancer stem cells，LCSCs)。本文对近年来的肝癌干细胞研究的最新进展作一综述。

1 肿瘤干细胞学说

肿瘤干细胞学说最先由Hamburger和Salmon提出，该学说认为:肿瘤的形成和发展是由一小群具有自我更新和分化潜能的细胞主导的过程，这类细胞在启动肿瘤形成和生长过程中起着决定性作用，是肿瘤生长、转移和复发的根源。他们通过软琼脂集落形成等一系列实验证实这一学说［3－4］。Passegué等［5］证明了AML细胞中只有0.2%～1.0%的细胞亚群有持续的克隆形成能力，并分离出这些Thy－、CD34+、CD38－细胞，再移植入NOD/SCID小鼠体内，发现它们是惟一能在免疫缺陷小鼠体内形成移植瘤的细胞，从而证明了这些细胞就是肿瘤干细胞。Reya等［6］通过对血液系统肿瘤的研究提出了系统的CSCs学说，并认为CSCs不仅存在于血液系统肿瘤，还存在于其他实体瘤中。目前，已有研究表明:在白血病、乳腺癌、人类中枢神经系统肿瘤、肺癌、结肠癌、甲状腺癌和卵巢癌等实体瘤中相应的CSCs存在的可能性［7－12］。CSCs除具有自我更新和多向分化能力等正常干细胞的基本特性外，还具有肿瘤细胞的特性，能够维持肿瘤的增殖和生长，逃避内源性及外源性调控自身内环境稳定的机制，并通过各种信号转导和调节通路参与肿瘤的发生、发展、转移和复发［13］。

2 肝癌干细胞的来源

目前，关于肝癌干细胞的来源有两种观点:1)肝癌干细胞起源于成熟肝细胞的去分化［14］;2)起源于肝干细胞的成熟受阻。根据CSCs学说，肝癌干细胞可能来自于肝干细胞的突变。近些年来，随着对于肝干细胞在肝癌形成过程中重要性的深入认识，越来越多的实验证明肝癌干细胞起源于肝干细胞［15－18］。肝干细胞的来源有两种可能，1)肝内来源即在肝脏发育成熟后，组织内仍保留少量处于休眠状态的干细胞;2)肝外来源即肝干细胞来源于其他组织，例如骨髓等。

Grozdanov等［15］将癌胚蛋白Gpc3可以作为肝祖细胞的标志物，并通过建立Solt-Farber肝脏致癌模型研究证实肝祖细胞/卵圆细胞与肝癌的发生有密切的关系。卵圆细胞是一类胞核呈卵圆形的小上皮细胞，是肝内胆管系统源性多潜能分化细胞群，既可向胆管细胞分化，又可向肝细胞分化，主要位于胚胎肝脏或成年肝脏的胆管末端Hering管。当肝脏损伤时，卵圆细胞能大量增殖，并迁移至肝脏实质，分化为肝细胞和胆管细胞，修复和重建肝脏。Dumble等［16］对敲除p53基因小鼠喂缺乏胆碱而补充乙硫氨酪酸的饮食，诱导卵圆细胞大量增生，分离卵圆细胞进行培养，将有永生化特性的细胞接种入NOD/SCID小鼠皮下长出与肝细胞癌相似的肿瘤，确定其由卵圆细胞分化而来，说明卵圆细胞可能参与肝癌的形成。

普遍认为肝干细胞主要存在于胆管末端Hering管中，但Oliva等［17］通过免疫组化和RNA-FISH技术发现肝癌组织中有肝干细胞的存在。研究发现，肝癌细胞与肝干细胞表达共同的表面标志物，也提示肝细胞癌可能起源于肝干细胞［18－19］。最近研究在肝癌组织中的具有干细胞特征的EpCAM(+)细胞引导了肝癌细胞的生长和转移，进一步提示肝干细胞与肝癌的发生有着密切的联系［20］。

3 肝癌干细胞表面标志物

肝干细胞可能为肝癌干细胞的来源，因此肝干细胞表达的某些表面标志物可能成为肝癌干细胞筛选的参考标志物。近年来，研究者从肝癌组织和细胞系中发现了CK7、CKI9、AFP、c-kit、OV6、Thy-1(CD90)、CD34等多种肝干细胞标志物。

CD133对于肝癌干细胞的研究具有一定的价值。据报道，在人肝癌细胞系中，CD133+细胞存在的比率是0%～65%，并具有高度增殖分化潜能和体内成瘤能力及干细胞样特性［21－23］。Suetsugu等［22］检测3个肝癌细胞系中仅Huh-7细胞亚群表达CD133，且仅有CD133阳性细胞具有更强的增殖、分化和成瘤能力。同样，Chiba等［23］研究发现，肝癌细胞系Huh-7细胞中具有表达CD133的干细胞，并且CD133+细胞具有更高的增殖潜能和体外分化能力。将CD133+细胞纯化后，与CD133－细胞同时接种于裸鼠背部皮下，观察比较两者的成瘤能力，结果显示:CD133+细胞仅需1× 103个细胞即可在裸鼠体内形成肿瘤，证明CD133+细胞具有更高的成瘤性。Sasaki等［24］对136个肝癌标本通过免疫组化分析和统计学方法评估CD133表达和临床病理学之间的关系，发现CD133的表达与肝癌患者的生存率及预后密切相关。最近，Kohga等［25］又通过金属蛋白酶的研究进一步证实了CD133+细胞在肝癌中的恶性潜能和特性。

CD90是一种相对分子质量25 000～37 000的糖蛋白，主要在白血病、骨髓间充质、乳腺癌、肝干/祖细胞细胞中表达［26－27］。Yang等［28］通过肝癌细胞系、肝癌组织和肝癌患者血样的研究，发现所有的肝癌标本和91.6%的肝癌患者血样中都有CD90+CD45－细胞群，将其分离出来接种到裸鼠和SCID/Beige小鼠体内能很好的成瘤，还通过小鼠实验证明了CD90+CD44+比CD90+CD44－具有更强的侵袭力，并与肝癌的原处和远处转移有密切关系。

最近，Haraguchi等［29］通过研究发现，CD13是肝癌干细胞系中处于半静止状态的一种标志物，主要存在于细胞周期的G0期，在肿瘤的中心形成细胞簇。通过药物实验证实了在鼠异种移植物模型中，CD13抑制剂能够有效的抑制肿瘤的自我更新和形成静止期肿瘤干细胞。由于肿瘤干细胞通常处于静止期，细胞周期循环较慢，而临床上使用的抗癌药大多是针对处于活跃期的肿瘤细胞起作用，从而导致肝癌对放化疗不敏感。故认为 CD13是肝癌干细胞的一种候选标志物。

EpCAM是最近发现的又一种新的标志物，Terris等［30］对235个肝癌标本进行基因图谱和免疫组化分析，并通过流式分选仪分选出EpCAM+细胞，发现Ep-CAM+具有干细胞样特性，且在免疫缺陷小鼠体内能够形成高度侵袭性的肿瘤;Wnt/beta联蛋白的活化可以强化EpCAM+细胞的能力，而RNA干扰则可抑制EpCAM+细胞，从而得出结论，肝癌的生长和侵袭性与EpCAM+细胞密切相关。从肝癌组织和细胞中分析出其所占的比例最高可达99.2%，且2×102个细胞即可在裸鼠体内成瘤，相对于其他标志物有更高的成瘤性［20］。

4 SP细胞与肝癌干细胞

侧群(side pulation，SP)细胞分选方法已被广泛应用于分选和鉴定肿瘤干细胞。SP细胞的发现为肿瘤干细胞的鉴别和分离提供了一种新的手段。该方法借助于SP细胞能排出Hoechst 33342染料这一特性，Hoechst 33342染料的排出依赖细胞膜上的一种ATP结合蛋白(ABCG2)运载体。

SP细胞也已应用于肝癌干细胞的鉴别。研究发现肝细胞癌组织中存在侧群细胞，其具有干细胞样特性。SP细胞虽不等同于肝癌干细胞，但SP细胞至少组成了肝癌干细胞的一部分。Shi等［31］研究表明，肝癌标本中存在SP细胞的比例与肝癌术后早期转移复发有关。Chiba等［32］在肝癌细胞系 Huh7及 PLC/ PRE/5均分离出 SP细胞，比例分别是 0.25%和0.80%，进一步分析了分离出的SP细胞的特性，发现他们具有更强的增殖能力和抗凋亡特性。SP细胞还具有自我更新和多向分化潜能，分离的SP细胞体外培养能产生SP细胞和非SP细胞。肝癌细胞系Huh-7及PLC/PRE/5中分离的SP细胞还具有高成瘤性，皮下注射1×103个SP细胞可以使NOD/SCID小鼠皮下成瘤，而注射1×106个非SP细胞仍不能成瘤。

但SP方法也不是一个完美的鉴别肝癌干细胞的方法，该方法也有局限性，主要原因是染料 Hoechst 33342具有DNA毒性，分选后的细胞生物学特性是否发生改变存有疑问［1］。

总之，目前尚未发现肝癌的特异性的表面标志物，但越来越多的研究证明了肝癌干细胞的存在。寻找肝癌干细胞的高度特异性标记物将会进一步揭示肝癌的发生、发展和转移机制，为研究肝癌新的治疗方法提供理论依据。

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R735.7

A

1673－5412(2011)03－0267－03

河南省基础与前沿计划(编号:072300450060);河南省医学科技攻关计划(编号:200703087)

葛丽丽(1981－)，女，硕士，主要从事肿瘤免疫学研究。E-mail:geli.929@163.com

杨小昂(1963－)，男，博士，研究员，主要从事肿瘤免疫学研究。E-mail:xiaoangyang@163.com

2010－12－29)