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种子消毒方法对大葱无菌苗培养的影响

2011-08-14陈运起刘世琦高莉敏王传增

中国蔬菜 2011年18期
关键词:次氯酸钠吐温发芽势

董 飞 陈运起 刘世琦 高莉敏 王传增

(1山东农业大学园艺科学与工程学院,山东泰安 271018;2山东省农业科学院蔬菜研究所,山东省设施蔬菜生物学重点实验室,国家蔬菜改良中心山东分中心,山东济南 250100)

大葱(Allium fistulosumL.)为百合科葱属二年生草本植物。我国栽培利用大葱的历史逾3 000 a,现全国各地均有栽培(周光华,1999)。近年来,随着分子生物技术的迅速发展和基因工程的日趋普及,利用转基因植株生产药物、疫苗和生物制剂愈加展示出广阔的应用前景和潜在的经济效益。在转基因植株的研究中,无菌苗的筛选和培育是试验成功的关键,而无菌苗一般由种子获得,因此,种子有效消毒显得尤为重要。迄今,各种灭菌方法报道颇多(Sommer et al.,1981;Dodds & Roberts,1996;Pierik,1997;吴良欢和陶勤南,1997,1999;杨岚 等,2008),但是有关大葱种子消毒的方法鲜有报道。本试验以大葱种子为材料,设计不同的消毒方法,观察记录大葱种子始发期、发芽率、发芽势及污染率,为大葱种子的有效消毒提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以山东省农业科学院蔬菜研究所提供的章丘大葱种子为试材。次氯酸钠、升汞、吐温20等药剂购自济南凯莱生物技术有限公司。

1.2 种子消毒处理

种子消毒处理方法:每个处理200粒种子,先将大葱种子用自来水冲洗30 min,然后置于超净工作台上用75%酒精漂洗0.5~1.0 min,转入消毒液中进行消毒处理,最后用无菌水冲洗3~5遍,接种于MS培养基。

种子消毒试验设计:① 2%次氯酸钠消毒20 min;② 2%次氯酸钠消毒40 min;③ 2%次氯酸钠消毒60 min;④ 0.1%升汞消毒5 min;⑤ 0.1%升汞消毒10 min;⑥ 0.1%升汞消毒15 min。

1.3 添加吐温20的种子消毒处理

吐温20是一种去污剂,不破坏蛋白的结构,能够湿润整个种子,促进消毒液进一步接触表面组织,吸附种子内部的内生菌,从而达到更好的消毒效果。

处理方法:每个处理100粒种子,先用自来水冲洗30 min,然后置于超净工作台上用75%酒精漂洗0.5~1.0 min,转入2%次氯酸钠消毒40 min,随后接种于MS培养基。

试验设计:① 大葱种子消毒前,用自来水冲洗时在三角瓶中加入 1~2滴吐温 20;② 大葱种子消毒后,用加入吐温20的无菌水〔无菌水中按10 000V∶1V(梁毅 等,2010)的比例添加吐温20〕冲洗3~5遍,最后用无菌水冲洗1遍;③ 处理1与处理2同时进行;④ 以正常消毒,不添加吐温20为对照。

1.4 大葱无菌苗培养

将处理后的种子接种于MS培养基(经高压灭菌)培养,培养基中添加3%蔗糖、0.9%琼脂,pH 5.8~6.0。培养温度(25±1)℃,光照强度3 000 lx,光照时间每天16 h。

1.5 数据分析

培养10 d时调查统计发芽势;培养30 d时调查统计发芽率、污染率;第1粒种子发芽的时间为种子发芽始期。采用SPSS软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 不同消毒方法对大葱种子发芽及消毒效果的影响

由表1可知,采用2%次氯酸钠、0.1%升汞两种试剂不同时间处理大葱种子,处理1的种子始发期最短,仅为3 d,与处理4、5差异显著,与处理 6差异极显著;在发芽率和发芽势方面,也是处理1最高,分别达88.0%和79.0%,且在发芽势上与其他 5个处理存在极显著差异,但是其污染率亦最高(12.0%),从而影响最终的成苗率。处理6的污染率最低,为1.0%,但发芽率和发芽势也最低,而且种子始发期比其他处理推迟2~4 d,不利于种子成苗。处理2种子始发期、发芽率与处理1无显著差异,但种子污染率较低(5%),是对大葱种子进行消毒,实现较高发芽率、较低污染率的理想方法。

表1 不同消毒方法对大葱种子发芽及消毒效果的影响

2.2 添加吐温20对大葱种子发芽及消毒效果的影响

由表2可知,在大葱种子消毒过程中添加吐温 20,能显著降低种子污染率,明显提高发芽势、发芽率,因此可以认定添加吐温 20对大葱种子消毒处理有积极作用。处理3消毒效果最佳,种子始发期提前 2 d,发芽势达81%、发芽率达90%,而污染率仅为2.5%。

表2 添加吐温20对大葱种子发芽及消毒效果的影响

3 结论与讨论

3.1 不同消毒方法的效果比较

种子消毒不仅要把表面的微生物杀死,而且不能伤害其组织和表层细胞,以获得不污染且存活率较高的外植体。常见的消毒剂有次氯酸钠、酒精、升汞、过氧化氢、漂白粉等。其中升汞的杀菌能力最强,但对外植体的伤害最大,毒性也大,污染环境。不同植株对升汞的耐受能力不同,Rao等(2006)采用0.1%升汞对棉花种子进行表面消毒时,消毒时间长达20 min也没有对种子造成伤害,但是解继红等(2009)在鹅观草属种子消毒试验中证明 0.1%升汞消毒3 min效果最佳。本试验采用0.1%升汞对大葱种子进行消毒(5~15 min)时,升汞对大葱种子的抑制作用太强,致使大葱种子生长势、发芽势弱,发芽持续时间长,且消毒效果也不如2%次氯酸钠。

3.2 添加吐温20对大葱种子消毒效果的影响

吐温20是一种亲水性强的非离子型去污剂,不破坏蛋白的结构,能够湿润整个种子,促进消毒液进一步接触表面组织,吸附种子内部的内生菌,从而达到更好的消毒效果(王利民 等,2002)。本试验结果表明,吐温 20在大葱种子消毒中能够有效的去除种子表面的灰尘和杂质,对大葱种子的有效消毒是十分重要的。尤其是在消毒前后均加吐温20(处理3),大葱种子的发芽率、发芽势有明显提高,而且污染率低。因此,用2%次氯酸钠消毒40 min,在消毒前后均添加吐温20为大葱种子有效的消毒方法。

解继红,于靖怡,陈景芋,徐柱.2009.鹅观草属种子消毒及无菌播种的研究.种子,28(3):25-27.

梁毅,王永勤,关绚丽,于春霞,张智,田保华.2010.不同消毒方法在洋葱组织培养中的应用.中国农学通报,26(21):223-226.

王利民,周毅,陈龙友.2002.植物组织培养中消毒剂的运用.贵州师范大学学报:自然科学版,20(1):15-17.

吴良欢,陶勤南.1997.水稻有机营养试验供试无菌苗的筛选和培育方法.浙江农业大学学报,23(6):711-715.

吴良欢,陶勤南.1999.植物有机营养无菌培养试验方法的研究与应用.土壤学报,36(4):551-558.

杨岚,唐琳,刘建国,吴家媛,马欣荣,杨德琴,张剑,关薇薇.2008.番茄种子两种灭菌法效果评价.贵州医药,32(1):26-28.

周光华.1999.蔬菜优质高产栽培的理论基础.济南:山东科学技术出版社:580.

Dodds J H,Roberts L W.1996.Experiments in plant tissue culture.London:Cambridge University Press:155.

Pierik R L M.1997.In vitro culture of higher plants.Netherlands:Kluwer Academic Publishers:89-94.

Rao A Q,Hussain S S,Shahzad M S,Bokhari S Y A,Raza M H,Rakha A,Majeed A,Shahid A A,Saleem Z,Husnain T,Riazuddin S.2006.Somatic embryogenesis in wild relatives of cotton(Gossypiumspp.).Journal of Zhejiang University Science B,7(4):291-298.

Sommer H E,Caldas L S,Crocomo O L,Aquarone E,Gottlieb O R.1981.Plant tissue culture:methods and application in agriculture.Orlando:Academic Press:379.

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