种子消毒方法对大葱无菌苗培养的影响

董 飞 陈运起 刘世琦 高莉敏 王传增

（1山东农业大学园艺科学与工程学院，山东泰安 271018；2山东省农业科学院蔬菜研究所，山东省设施蔬菜生物学重点实验室，国家蔬菜改良中心山东分中心，山东济南 250100）

大葱（Allium fistulosumL.）为百合科葱属二年生草本植物。我国栽培利用大葱的历史逾3 000 a，现全国各地均有栽培（周光华，1999）。近年来，随着分子生物技术的迅速发展和基因工程的日趋普及，利用转基因植株生产药物、疫苗和生物制剂愈加展示出广阔的应用前景和潜在的经济效益。在转基因植株的研究中，无菌苗的筛选和培育是试验成功的关键，而无菌苗一般由种子获得，因此，种子有效消毒显得尤为重要。迄今，各种灭菌方法报道颇多（Sommer et al.，1981；Dodds & Roberts，1996；Pierik，1997；吴良欢和陶勤南，1997，1999；杨岚 等，2008），但是有关大葱种子消毒的方法鲜有报道。本试验以大葱种子为材料，设计不同的消毒方法，观察记录大葱种子始发期、发芽率、发芽势及污染率，为大葱种子的有效消毒提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以山东省农业科学院蔬菜研究所提供的章丘大葱种子为试材。次氯酸钠、升汞、吐温20等药剂购自济南凯莱生物技术有限公司。

1.2 种子消毒处理

种子消毒处理方法：每个处理200粒种子，先将大葱种子用自来水冲洗30 min，然后置于超净工作台上用75%酒精漂洗0.5～1.0 min，转入消毒液中进行消毒处理，最后用无菌水冲洗3～5遍，接种于MS培养基。

种子消毒试验设计：① 2%次氯酸钠消毒20 min；② 2%次氯酸钠消毒40 min；③ 2%次氯酸钠消毒60 min；④ 0.1%升汞消毒5 min；⑤ 0.1%升汞消毒10 min；⑥ 0.1%升汞消毒15 min。

1.3 添加吐温20的种子消毒处理

吐温20是一种去污剂，不破坏蛋白的结构，能够湿润整个种子，促进消毒液进一步接触表面组织，吸附种子内部的内生菌，从而达到更好的消毒效果。

处理方法：每个处理100粒种子，先用自来水冲洗30 min，然后置于超净工作台上用75%酒精漂洗0.5～1.0 min，转入2%次氯酸钠消毒40 min，随后接种于MS培养基。

试验设计：① 大葱种子消毒前，用自来水冲洗时在三角瓶中加入 1～2滴吐温 20；② 大葱种子消毒后，用加入吐温20的无菌水〔无菌水中按10 000V∶1V（梁毅 等，2010）的比例添加吐温20〕冲洗3～5遍，最后用无菌水冲洗1遍；③ 处理1与处理2同时进行；④ 以正常消毒，不添加吐温20为对照。

1.4 大葱无菌苗培养

将处理后的种子接种于MS培养基（经高压灭菌）培养，培养基中添加3%蔗糖、0.9%琼脂，pH 5.8～6.0。培养温度（25±1）℃，光照强度3 000 lx，光照时间每天16 h。

1.5 数据分析

培养10 d时调查统计发芽势；培养30 d时调查统计发芽率、污染率；第1粒种子发芽的时间为种子发芽始期。采用SPSS软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 不同消毒方法对大葱种子发芽及消毒效果的影响

由表1可知，采用2%次氯酸钠、0.1%升汞两种试剂不同时间处理大葱种子，处理1的种子始发期最短，仅为3 d，与处理4、5差异显著，与处理 6差异极显著；在发芽率和发芽势方面，也是处理1最高，分别达88.0%和79.0%，且在发芽势上与其他 5个处理存在极显著差异，但是其污染率亦最高（12.0%），从而影响最终的成苗率。处理6的污染率最低，为1.0%，但发芽率和发芽势也最低，而且种子始发期比其他处理推迟2～4 d，不利于种子成苗。处理2种子始发期、发芽率与处理1无显著差异，但种子污染率较低（5%），是对大葱种子进行消毒，实现较高发芽率、较低污染率的理想方法。

表1 不同消毒方法对大葱种子发芽及消毒效果的影响

2.2 添加吐温20对大葱种子发芽及消毒效果的影响

由表2可知，在大葱种子消毒过程中添加吐温 20，能显著降低种子污染率，明显提高发芽势、发芽率，因此可以认定添加吐温 20对大葱种子消毒处理有积极作用。处理3消毒效果最佳，种子始发期提前 2 d，发芽势达81%、发芽率达90%，而污染率仅为2.5%。

表2 添加吐温20对大葱种子发芽及消毒效果的影响

3 结论与讨论

3.1 不同消毒方法的效果比较

种子消毒不仅要把表面的微生物杀死，而且不能伤害其组织和表层细胞，以获得不污染且存活率较高的外植体。常见的消毒剂有次氯酸钠、酒精、升汞、过氧化氢、漂白粉等。其中升汞的杀菌能力最强，但对外植体的伤害最大，毒性也大，污染环境。不同植株对升汞的耐受能力不同，Rao等（2006）采用0.1%升汞对棉花种子进行表面消毒时，消毒时间长达20 min也没有对种子造成伤害，但是解继红等（2009）在鹅观草属种子消毒试验中证明 0.1%升汞消毒3 min效果最佳。本试验采用0.1%升汞对大葱种子进行消毒（5～15 min）时，升汞对大葱种子的抑制作用太强，致使大葱种子生长势、发芽势弱，发芽持续时间长，且消毒效果也不如2%次氯酸钠。

3.2 添加吐温20对大葱种子消毒效果的影响

吐温20是一种亲水性强的非离子型去污剂，不破坏蛋白的结构，能够湿润整个种子，促进消毒液进一步接触表面组织，吸附种子内部的内生菌，从而达到更好的消毒效果（王利民 等，2002）。本试验结果表明，吐温 20在大葱种子消毒中能够有效的去除种子表面的灰尘和杂质，对大葱种子的有效消毒是十分重要的。尤其是在消毒前后均加吐温20（处理3），大葱种子的发芽率、发芽势有明显提高，而且污染率低。因此，用2%次氯酸钠消毒40 min，在消毒前后均添加吐温20为大葱种子有效的消毒方法。

解继红，于靖怡，陈景芋，徐柱．2009．鹅观草属种子消毒及无菌播种的研究．种子，28（3）：25-27.

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王利民，周毅，陈龙友．2002．植物组织培养中消毒剂的运用．贵州师范大学学报：自然科学版，20（1）：15-17.

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