Akt抑制剂鱼藤素对膀胱癌T-24细胞化疗敏感性的影响

江克华 董自强 宋兴福 龙兵 刘幼昆 袁红纲韩钰 王艳林 曾欢

1.三峡大学第一临床医学院泌尿外科，湖北 宜昌 443003；2.三峡大学分子生物学研究所，湖北 宜昌 443002

2010年美国癌症学会公布了美国癌症的最新统计数据，男性膀胱癌的发病率占全身肿瘤的7%，居第四位，死亡率占全身肿瘤的3%，居第九位；女性膀胱癌的发病率占全身肿瘤的2.4%，死亡率占全身肿瘤的1.58%［1］。而在我国，膀胱癌是泌尿外科最常见的肿瘤，占全部恶性肿瘤的3.2%［2］。在新发现的膀胱癌中，约40%分化不良，就诊时可能半数已经浸润至肌肉层，并有潜在隐性转移病灶，一旦发生转移，多数在2年内死亡。因此研究抗膀胱癌的药物成为极具挑战性的课题。化疗是治疗膀胱癌的一个重要方法，目前临床上应用的化疗药物主要有甲氨蝶呤、多柔比星、顺铂、氟尿嘧啶等，虽然有一定的疗效，但是不良反应较大，给药剂量受到限制，从而影响了化疗药物疗效的发挥，治疗指数低。Akt又称蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，是 PI3K信号通路下游重要的效应子，Akt凭借其在细胞信号网络的枢纽地位成为多种肿瘤发生发展、侵袭转移机制乃至靶向治疗的研究热点［3］。因此本实验研究Akt抑制剂鱼藤素联合顺铂对膀胱癌T-24细胞的影响，为临床应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

膀胱癌T-24细胞株由华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科惠赠；DMEM培养液、MTT、二甲基亚砜购自美国GIBCO公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司；鱼藤素购自瑞士Enzo Life Sciences公司；顺铂购自齐鲁制药有限公司；全波长酶标仪购自Thermo Electron公司；流式细胞仪购自美国贝克曼公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

膀胱癌T-24细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液(含100 U/mL的青霉素和100 U/mL的链霉素)置于37 ℃、CO2体积分数为5%的细胞培养箱中培养，用0.25%的胰酶消化传代，取对数生长期的细胞进行试验。

1.2.2 细胞增殖抑制试验(MTT法)

将T-24细胞以5 000个/孔接种于96孔培养板，每孔100 μL。分组如下：⑴鱼藤素组，分别按10、100、500和1 000 nmol/L浓度梯度给药；⑵顺铂组，分别按0.25、0.5、1和2 μg/mL浓度给药；⑶联合用药组，鱼藤素浓度为10、100、500和1 000 nmol/L，顺铂浓度为0.25、0.5、1和2 μg/mL，按对应浓度两两进行组合给药。每组均设3个复孔，并设置调零孔(只含DMEM培养液，无细胞)和对照孔(只含细胞、培养液)，待药物作用24、48和72 h后弃上清液，每孔加入无血清DMEM培养液100 μL及MTT(5 mg/mL)20 μL，继续培养4 h后取出培养板，弃上清液，每孔加150 μL DMSO，振荡使晶体溶解，用全波长酶标仪测定波长570 nm处的吸光度值(D)，实验重复3次，取平均值，按下式计算细胞生长抑制率：生长抑制率(%)=(1-D药物组平均570值/D对照组平均570值)×100%。

按金正均［4］提出的概率和法计算D值并判断2药的协同作用，D=E(A+B)/［EA +(1-EA)×EB］，其中E(A+B)为2药联合应用时的细胞增殖抑制率，EA、EB分别为2药单独应用时的细胞增殖抑制率。当D为0.85～1.15时，表示2药作用相加，当D>1.15时，表示2药作用协同，当D

1.2.3 FCM测细胞周期及凋亡

由MTT检测发现，当鱼藤素浓度为10 nmol/L、顺铂浓度0.25 μg/mL时，二者联合即能显著提高顺铂对T-24细胞的敏感性，故选择此浓度组合进行后续试验。试验分组为：对照组(只含细胞、培养液)、鱼藤素组(10 nmol/L)、顺铂组(0.25 μg/mL)及二者的联合组。细胞贴壁24 h后，对照组加入等体积培养液，其余各组加入相应的药物浓度，继续培养，于72 h后收集细胞，70%乙醇和0.5 mmol/L EDTA的PBS混合液重悬细胞，于4 ℃固定30 min，2 000 r/min离心5 min(r=13.5 cm)，弃上清用PBS洗1次，用500 μL含有0.1% Triton X-100和50 μg/mL RNAse的PBS混合液重悬细胞，加入90 μL PI(0.5 mg/mL)避光温育30 min，经尼龙网过滤，用流式细胞仪进行分析。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 鱼藤素、顺铂以及联合给药抑制T-24细胞的增殖

MTT实验结果表明鱼藤素和顺铂均能抑制T-24细胞的生长(P<0.01)，联合给药对T-24细胞抑制作用更加明显(P<0.01，表1)。经计算Q值显示(表2)，鱼藤素与顺铂联合应用均显示出相加(Q值为0.85～1.15)或协同作用(Q>1.15)。

表1 鱼藤素、DDP单独及联合给药作用于膀胱癌T-24细胞的增殖抑制率Tab.1 The proliferation inhibition rates of bladder cancer cell line T-24 treated with deguelin, DDP and combined medication(n=9)

2.2 鱼藤素、顺铂及联合给药对T-24细胞周期和凋亡的影响

FCM结果显示，鱼藤素、顺铂使细胞的生长主要阻滞在S期，联合给药使细胞主要阻滞在G0/G1期，联合用药组与单药组比较，差异有统计学意义(P<0.01，表3)。但是二者单独及联合作用于T-24细胞72 h后，均未显示出对T-24细胞明显的诱导凋亡作用(P<0.05)。

表2 鱼藤素联合DDP作用膀胱癌T-24细胞的Q值Tab.2 Q values of bladder cancer cell line T-24 treated with deguelin and DDP

表3 鱼藤素、顺铂联合用药72 h对T-24细胞周期的影响Tab.3 Effects of deguelin, cisplatin and combined medication on the T-24 cell cycle(n=9)

3 讨 论

目前针对膀胱癌的化疗虽然取得了一定的疗效，但存在不良反应大、化疗不敏感以及抵抗等问题，因此如何提高化疗的敏感性，成为亟需解决的问题。而Akt作为PI3K/Akt通路的关键分子，在促进细胞的生长、增殖、促进肿瘤细胞的侵袭和转移、抑制细胞凋亡、促进血管生成、抵抗化疗和放疗中细胞的凋亡中起着核心作用［5］。在多种肿瘤如膀胱癌［6］、前列腺癌、胃癌及肺癌中都有Akt的过表达或活化。有研究发现Akt与乳腺癌患者化疗耐药和放疗抵抗有关，其异常活化可促使乳腺癌恶性进展，导致预后不良［7］。还有研究报道，Akt 抑制剂可增加体内或体外肿瘤细胞对化疗和(或)放疗的敏感度［8］。因此可通过调控Akt的表达或活化来提高化疗的敏感性。

目前对Akt抑制剂的研究进行的如火如荼，其抑制剂对多种肿瘤抑制作用明显［9-10］。而且Akt抑制剂具有肿瘤选择性，对正常细胞无不良反应，与传统化疗药物联合应用有协同效应。Akt抑制剂perifosine体外实验显示其具有明确的抗肿瘤活性，且联合放疗、化疗治疗实体瘤的抗癌作用明显［11-12］。鱼藤素是一种新型的Akt抑制剂，有很强的抗肿瘤作用［13］，在低药物浓度水平即可抑制多种肿瘤细胞的生长，且对肿瘤细胞有很强的选择性［14］。重要的是，动物实验显示鱼藤素在有效的浓度范围发挥抗癌作用的同时未发现有明显不良反应［15］。国内学者发现鱼藤素对前列腺癌细胞抑制作用明显，呈现时间、浓度依赖性，且将细胞周期阻滞在G2/M期［16］，而有研究发现鱼藤素能够将HUVE细胞生长周期阻滞在G0/G1期［13-14］。本研究MTT法显示鱼藤素对T-24细胞的生长抑制明显，而联合给药能够增加顺铂对T-24细胞的敏感性，FCM发现鱼藤素、顺铂使细胞的生长周期主要阻滞在S期，而联合给药使细胞主要阻滞在G0/G1期，这与其他报道是一致的［13-14］。

综上所述，Akt抑制剂鱼藤素对T-24细胞有明显的抑制作用，能够增加传统化疗药物顺铂对膀胱癌T-24细胞的化疗敏感性，是治疗膀胱癌极具有希望的靶向药物，我们的研究为鱼藤素治疗膀胱癌患者以及为提高膀胱癌患者的化疗疗效提供了一定的理论基础，但临床应用还有待进一步研究。

［1］ JEMAL A, SIEGEL R, XU J, et al. Cancer statistics, 2010［J］. CA Cancer J Clin, 2010, 60(5): 277-300.

［2］ 吴阶平, 吴阶平泌尿外科学［M］. 济南: 山东科学技术出版社, 2004: 965-966.

［3］ CARNERO A. The PKB/AKT pathway in cancer［J］. Curr Pharm Des, 2010, 16(1): 34-44.

［4］ 金正均. 合并用药中的相加［J］. 中国药理学报, 1980,1(2): 70-76.

［5］ MANNING B D, CANTLEY L C. AKT/PKB signaling:Navigating downstream ［J］. Cell, 2007, 129(7): 1261-1274.

［6］ CHING C B, HANSEL D E, et al. Expanding therapeutic targets in bladder cancer: the PI3K/Akt/mTOR pathway［J］.Lab Invest, 2010, 90(10): 1406-1414.

［7］ TOKUNAGA E, KIMURA Y, MASHINO K, et al. Activation of PI3K/Akt signaling and hormone resistance in breast cancer［J］. Breast Cancer, 2006, 13(2): 137-144.

［8］ PÉREZ-TENORIO G, STAL O. Southeast Sweden Breast Cancer Group. Activation of AKT/PKB in breast cancer predicts a worse outcome among endocrine treated patients［J］. Br J Cancer, 2002, 86(4): 540-545.

［9］ EVANGELISTI C, RICCI F, TAZZARI P, et al. Preclinical testing of the Akt inhibitor triciribine in T-cell acute lymphoblastic leukemia［J］. J Cell Physiol, 2011, 226(3):822-831.

［10］ YAP T A, WALTON M I, HUNTER L J, et al. Preclinical pharmacology, antitumor activity, and development of pharmacodynamic markers for the novel, potent AKT inhibitor CCT128930［J］. Mol Cancer Ther, 2011, 10(2): 360-371.

［11］ ELROD H A, LIN Y D, YUE P, et al. The alkylphospholipid perifosine induces apoptosis of human lung cancer cells requiring inhibition of Akt and activation of the extrinsic apoptotic pathway［J］. Mol Cancer Ther, 2007, 6(7): 2029-2038.

［12］ VINK S R, SCHELLENS J H, BEIJNEN J H, et al. PhaseⅠ and pharmacokinetic study of combined treatment with perifosine and radiation in patients with advanced solid tumours［J］. Radiother Oncol, 2006, 80(2): 207-213.

［13］ DELL’ EVA R, AMBROSINI C, MINGHELLI S,et al. The Akt inhibitor deguelin, is an angiopreventive agent also acting on the NF-kappaB pathway ［J］. Carcinogenesis, 2007, 28(2):404-413.

［14］ CHUN K H, KOSMEDER J W Ⅱ, SUN S, et al. Effects of deguelin on the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway and apoptosis in premalignant human bronchial epithelial cells［J］. J Natl Cancer Inst, 2003, 95(4): 291-302.

［15］ MURILLO G，KOSMEDER J W Ⅱ，PEZZUTO J M，et al. Deguelin suppresses the formation of carcinogen-induced aberrant crypt foci in the colon of CF-1 mice［J］. Int J Caneer, 2003, 104(l): 7-11.

［16］ 朱一平, 叶定伟, 姚旭东, 等. 鱼藤素诱导人前列腺癌细胞凋亡及其机制研究［J］. 中华实验外科杂志, 2008,25(10): 1329-1331.