Snail mRNA与HSP70 mRNA在宫颈鳞癌中的表达及其与生物学特征的关系

熊正文 张华东 胡海霞 黄勇 李宏伟 寻凤华

中国人民解放军二五一医院病理科(北京军区肿瘤病理技术研究诊疗中心)，河北 张家口 075000

宫颈鳞癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，其发病率及病死亡率呈逐年上升趋势［1］。近年研究表明，转录抑制因子Snail［2-4］和热休克蛋白70(heat shock proteins 70，HSP70)［5-7］与人体肿瘤的发生、发展、侵袭及转移等关系十分密切。本研究应用原位杂交(in situ hybridization，ISH)技术检测了Snail mRNA及HSP70 mRNA在宫颈良、恶性病变中的表达及其与宫颈癌生物学病理特征的关系，旨在分子水平探讨两者的表达与宫颈癌生物学特征的相关性。

1 资料和方法

1.1 一般资料

收集本科2008—2010年间宫颈组织标本蜡块共120例，其中慢性宫颈炎15例，宫颈上皮内瘤样变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)35例，宫颈癌70例，均经病理确诊，未进行术前放化疗；宫颈癌患者年龄26～87岁，中位年龄48岁，其中36例≤48岁，34例> 48岁；70例宫颈癌标本中，高分化19例，中分化44例，低分化7例。根据国际妇产科联盟(FIGO)临床分期标准，70例宫颈癌标本中，Ⅰ期17例，Ⅱ期43例，Ⅲ期10例。浸润癌浸润深度为：＜1/3者51例，≥1/3者19例，伴淋巴结转移者24例，无淋巴结转移者46例。

1.2 试剂及其来源

Snail、HSP70原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，探针为针对人Snail靶基因的mRNA序列：5’-AGAGTTTACC TTCCAGCAGCCCTACGACCAGGCCC-3’；5’-AAGGCCTTCAACTGCAAATACTGCAACAAG GAATA-3’；5’-TACCAGTGCCAGGCGTGTG CTCGGACCTTCTCCCG-3’。HSP70靶基因的mRNA探针序列为：5’-CCTGGCAGCCCTT TCTCAAGGACCACCGCA-3’；5’-AAGCATTCG TCCGGTTGCGCTTTCCTTTCT-3’；5’-AG AAAGTGCGCCGTGCCATCGAGCAGCTGG-3’。显示系统为生物素化鼠抗地高辛和过氧化物酶标记链霉卵白素(SABC-POD)，DAB显色。

1.3 原位杂交

石蜡切片复温，脱蜡至水。3%H2O2室温作用10 min，蒸馏水洗3次，3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶室温消化30 min。1%多聚甲醛室温固定10 min，蒸馏水洗3次，按每张切片滴加20 μL预杂交液，湿盒放入40 ℃恒温箱中4 h。滴加杂交液每片20 μL，38～42 ℃恒温箱中过夜。37 ℃预温的2×SSC冲洗5 min×3次，37 ℃预温的0.5×SSC冲洗5 min×3次，37 ℃预温的0.2×SSC冲洗5 min×3次。滴加封闭液，37 ℃30 min。滴加生物素化鼠抗地高辛，37 ℃60 min。滴加SABC，37 ℃ 20 min。滴加生物素过氧化物酶，37 ℃ 20 min。DAB避光显色，苏木素复染、脱水、透明、中性树胶封片，每批染色均用已知阳性切片作为阳性对照，用PBS代替杂交液作为阴性对照。

1.4 结果判断

Snail、HSP70原位分子杂交阳性信号为棕黄色颗粒，定位于细胞质。每例切片选择10个高倍视野，按阳性细胞数占视野中总细胞数的百分比分为阳性与阴性，无阳性着色或阳性细胞数＜10%为阴性，阳性细胞数≥10%为阳性［8］。HSP70 mRNA原位分子杂交阳性信号为棕黄色颗粒，定位于细胞质，每例切片选择10个高倍视野，由2名经验丰富的病理医生以盲审法确定阳性率。

1.5 统计学处理

数据采用SPSS 17.0统计分析软件处理，运用χ2检验分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Snail及HSP70 mRNA在宫颈病变中的表达

Snail mRNA、HSP70 mRNA、原位分子杂交阳性信号在慢性宫颈炎组织、宫颈鳞状上皮内瘤变和宫颈鳞状细胞癌中均有不同程度的表达，呈棕黄色，阳性表达产物定位于细胞质，呈明显的棕黄色弥漫性颗粒状表达。70例宫颈鳞状细胞癌组织中，Snail mRNA阳性率为80.0%(56/70)，分别高于宫颈鳞状上皮瘤变组织60.0%(21/35)和宫颈慢性炎症20.0%(3/15)，差异均有统计学意义(χ2=4.773，P<0.05和χ2=18.215，P<0.05，图1、表1)；HSP70 mRNA宫颈鳞状细胞癌组织中阳性率为85.7%(60/70)，分别高于宫颈鳞状上皮瘤变组织45.7%(16/35)和宫颈慢性炎症26.7%(4/15)，差异均有统计学意义(χ2=16.728，P<0.01和χ2=20.088，P<0.01，图2、表1)。

2.2 Snail mRNA及HSP70 mRNA的表达与宫颈鳞状细胞癌患者临床病理特征的关系

Snail mRNA在淋巴结转移组明显高于无转移组(P<0.05)；而在不同年龄、FIGO分期、病理分级及浸润深度情况之间，Snail mRNA、HSP70 mRNA无明显变化(P均>0.05，表2)。

2.3 宫颈鳞状细胞癌组织中Snail及HSP70 mRNA表达的关系

图1 Snail mRNA在慢性宫颈炎(A)、CINⅡ级(B)和中分化鳞状细胞癌(C)组织中阳性表达Fig.1 Snail mRNA positive expression in chronic cervicitis (A), CINⅡ grade (B) and in moderately differentiation cervical squamous cancer (C)(ISH, ×200)

图2 HSP70 mRNA在慢性宫颈炎(A)、CINⅡ级(B)和中分化鳞状细胞癌(C)组织中阳性表达Fig.2 HSP70 mRNA positive expression in chronic cervicitis (A), CINⅡ grade (B) and in moderately differentiation cervical squamous cancer (C)(ISH, ×200)

表1 Snail及HSP70 mRNA在宫颈各类型组织中的表达情况Tab.1 The expression of Snail mRNA and HSP70 mRNA in various cervical tissues

表2 Snail mRNA及HSP mRNA表达与宫颈鳞状细胞癌患者临床病理特征的关系Tab.2 Correlation of Snail mRNA and HSP70 mRNA expression with clinic pathological features in cervical squamous cancer

经Spearman相关性检验分析显示，随着HSP70 mRNA阳性表达增强，Snail mRNA的阳性表达明显增高，两者在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达呈正相关(r=0.306，P<0.05，表3)。

表3 宫颈鳞状细胞癌中Snail mRNA和HSP mRNA表达的相关性Tab.3 Relationship between expression of Snail mRNA and HSP70 mRNA in cervical squamous cancer

3 讨 论

Snail首先发现于果蝇中，是一类锌指转录因子，因在许多恶性肿瘤中呈高表达而备受关注。Snail属于锌指蛋白Snail超家族，通过与Smad相互作用蛋白(Smad-interacting protein-1，SIP1)竞争性结合E-cadherin启动子区的E-box序列，抑制E-cadherin、occludin等的表达，上调FSP1、vimentin和Rho等的表达，从而诱导上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的发生，提高细胞侵袭转移能力，所以Snail可以被看作肿瘤转移的促进因素［9-10］，其高表达于乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌和食管癌等，并与肿瘤的转移和组织学分级密切相关［11-12］。本研究发现Snail mRNA在宫颈慢性炎症、宫颈鳞状上皮瘤变和宫颈鳞状细胞癌阳性率分别是20%(3/15)、60%(21/35)和80%(56/70)，从慢性炎症、癌前病变到恶性病变，Snail表达呈逐渐增高的趋势，而差异均有统计学意义(P<0.05)，提示Snail基因与宫颈鳞状细胞癌发生有密切关系。Snail mRNA在有淋巴结转移组阳性表达率为95.8%，明显高于无转移组71.7%(P<0.05)，而在不同年龄、FIGO分期、病理分级及浸润深度情况之间差异无统计学意义(P>0.05)，结果提示宫颈鳞癌中Snail mRNA表达与淋巴结转移转移呈正相关。

热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是机体在应激状态下产生一组高度保守的蛋白质［13］，由真核细胞产生，参与多种蛋白的折叠、装配及转运等蛋白质加工修饰过程，具有“分子伴侣(molecular chaperone)的”作用［14-15］。HSPs在细胞周期调节、DNA损伤修复、基因产物代谢等过程中起重要作用。HSP又称应激蛋白，在正常细胞中表达很低，在高热、乙醇中毒、病毒感染、氨基酸类似物储积、DNA损伤、缺氧、重金属离子过多、细胞内出现变性自身蛋白等应激因素影响下，细胞内HSPs表达增强，维持细胞内环境的稳定，使细胞耐受应激损伤，这是细胞的一种自身保护［16］。HSPs按其相对分子质量大小分为若干家族，在众多的HSPs中，以HSP60、HSP70在大多数生物细胞中含量最多［17］。近年来的研究侧重于HSP70蛋白与肿瘤的关系，但从分子水平探讨HSP70 mRNA与肿瘤关系的报道少见。因此，我们应用高灵敏度的核酸原位杂交的技术探讨了HSP70 mRNA表达在宫颈鳞癌发生、发展中的作用及其与临床病理特征的关系，结果发现：HSP70 mRNA在宫颈慢性炎症、宫颈鳞状上皮瘤变和宫颈鳞状细胞癌阳性率分别是26.7%(4/15)、45.7%(16/35)和85.7%(60/70)，从良性、癌前病变到恶性病变呈逐渐增高的趋势，而差异均有统计学意义(P<0.05)，结果提示HSP70与宫颈鳞状细胞癌发生有着十分密切关系。研究还发现HSP70 mRNA在有淋巴结转移组阳性表达率为91.7%，高于无转移组的82.6%，而在不同年龄、FIGO分期、病理分级及浸润深度情况之间差异无统计学意义(P>0.05)，结果提示宫颈鳞癌中HSP70 mRNA表达与淋巴结转移无相关性，可能与标本量过少有关。HSP70的高表达一方面介导癌基因及抑癌基因产物的构象成熟、跨膜转运，另一方面介导错配蛋白的降解，协调肿瘤细胞的蛋白质代谢平衡，使肿瘤细胞无限增殖。

HSPs与细胞转化和恶变过程密切相关［18］。肿瘤组织中的HSPs可抑制肿瘤生长和转移，容易诱发肿瘤细胞凋亡，还与肿瘤多药耐药的形成有关［19］。本组70例宫颈鳞状细胞癌组织中，Snail mRNA和HSP mRNA表达在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达正相关(r=0.306，P<0.05)。Snail和HSP70表达与肿瘤的恶性程度呈正相关，因此，联合检测Snail mRNA和HSP70 mRNA的表达对判断宫颈鳞状细胞癌的恶性程度、预测淋巴结转移及预后有重要意义。

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