地黄饮子含药脑脊液对受损PC12细胞β－淀粉样前体蛋白mRNA表达的干预

何秀丽，孟菲，周妍妍，谢宁

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

老年性痴呆(Alzheimer＇s disease，AD)，是发生于老年前期或老年期的大脑退行性疾病，因脑内细胞外β－淀粉样蛋白(β－amyloid，Aβ)沉积形成的神经炎性斑，是其特征性的病理变化;以慢性进行性不可逆的记忆减退、认知障碍及人格改变为临床主要特征［1－2］。现已公认，Aβ为阿尔茨海默病致病的关键因素之一［3－4］。PC12细胞具有典型神经内分泌细胞的特性，是研究神经系统疾病的最常见细胞株，来源于大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤，可作为良好的神经系统体外模型［5－6］。本研究采用“老化”状态的 Aβ 作用于 PC12细胞后β－淀粉样蛋白基因表达的变化，观察地黄饮子含药脑脊液对其的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药物

大耳白家兔，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。地黄饮子浓缩液(2g/ml)，于4℃保存备用。实验阳性对照药:盐酸多奈哌齐。

1.2 试剂、仪器

SYBR®ExScriptTMRT－PCR kit(Perfect Real Time)DRR053S(TAKARA公司);高糖DMEM培养基、D－Hanks缓冲液(Hyclon公司);胎牛血清(杭州四季青公司);链霉素、青霉素、Aβ25－35(Sigma公司);胰蛋白酶(Gibco公司);二氧化碳培养箱(TC 2323D型，中国广州南方生化医学部);Real Time PCR System(7300型，美国ABI公司);PCR System扩增仪(2700型，Applied Biosystems公司);紫外可见分光光度计(UV－2550型，日本岛津)。

1.3 方法

细胞培养、预处理:购于中科院上海细胞库PC12细胞置于DMEM培养基中，其中含有10%胎牛血清和1%青链霉素抗生素。细胞培养环境为37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱，实验选材为处于对数生长期细胞。

提取含药脑脊液:体质量2kg大耳白家兔，适应性喂养3天，然后连续3天灌服地黄饮子水煎剂，盐酸多奈哌齐溶液。末次灌胃后1h立即给予戊巴比妥钠静脉麻醉抽取200μl脑脊液，冻存－70℃备用。

实验分组、建立PC12细胞AD模型:实验分为6组:空白组，模型组，西药对照组，地黄饮子低、中、高剂量组;空白组为细胞培养液，其它各组加入含药脑脊液，37℃孵育2h后，除空白组之外的各组分别加入经老化处理(37℃孵育24h)、终浓度为 10μmol/L的Aβ25－35，建立 PC12细胞的 AD 模型，继续孵育24h，进入实验的取材阶段。

1.4 荧光实时定量PCR检测地黄饮子脑脊液对PC12细胞APPmRNA表达

1)提取总RNA:首先除去细胞培养液，用PBS冲洗3次。采用trizol法提取总RNA。

2)目的基因序列:APP，Forward，5'－TGG GTT GAC AAA CAT CAA GAC AGA A －3';Reverse，5'－GCA CCT TTG TTT GAA CCC ACA TC －3'。

3)逆转录反应:反转录反应42℃ 15min，反转录酶失活反应95℃ 2min。

4)PCR反应:在ABI7300荧光定量PCR仪采用SYBR Premin ExTap(Perfect Real Time)kit试剂进行这一过程。由熔解曲线判断PCR反应特异性。整个过程收集荧光，反应结束后软件分析检测样本的Ct值，Ct值随模板浓度的增大而减少。APP mRNA表达是以差别倍数2－△△Ct来表示。△△Ct=△Ct各干预组－△Ct空白组;△Ct=Ct APP－Ct GAPDH。

2 结果

2.1 产物鉴定 PCR各产物的熔解曲线单一峰，可判断为单一片段扩增，反应熔解温度APP为82.6℃，GAPDH为86.7℃。扩增产物经2%琼脂糖电泳长度GAPDH和APP均在120～150bp之间，与设计的片断长度相符合。实时定量PCR产物2%凝胶电泳图见图1。

图1 APP电泳图

图2 相对浓度对数值

2.2 扩增效率分析 随机选择一个样本的RNA反转录成cDNA，并以2倍梯度稀释，以相对浓度为1、0.5、0.25、0.125作为实时PCR的模板进行扩增。APP和GAPDH的Ct值与之对应的相对浓度对数值作图(见图2)，GAPDH和APP对应的直线斜率为－3.338 4和－3.308 5，扩增效率按 E=10－1/slope计算，EAPP 为2.005 4，EGAPDH为1.993 2，结果表明，扩增效率一致，即2－ΔΔCt相对定量方法适合于本试验，数据用(s)表示，用SPSS 11.5进行统计分析。

2.3 地黄饮子含药脑脊液对受损 PC12细胞APP mRNA表达的影响

分别扩增 GAPDH 和 APP，通过2－△△Ct计算得到APP相对mRNA表达水平。结果见表1。

表1 APP mRNA相对定量表达水平(s)

表1 APP mRNA相对定量表达水平(s)

注:与模型组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与西对组比较，○P ＞0.05。

组别 n Ct GAPDH Ct APP △ct －△△ct 2－△△ct空白组5 13.595 ±0.157 18.473 ±0.174 4.878 ±0.093 － －模型组 5 13.583 ±0.117 17.131 ±0.059 3.548 ±0.148 1.330 ±0.156 2.526 ±0.264西对组 5 13.631 ±0.197 17.432 ±0.173 3.800 ±0.256 1.077 ±0.240 2.134 ±0.361*中低组 5 13.683 ±0.235 17.478 ±0.062 3.795 ±0.196 1.082 ±0.180 2.132 ±0.275＊○中中组 5 13.664 ±0.151 17.489 ±0.157 3.825 ±0.261 1.053 ±0.250 2.010 ±0.353＊○中高组 5 13.621 ±0.089 17.633 ±0.094 4.011 ±0.141 0.867 ±0.010 1.827 ±0.125＊＊○

结果表明:模型组APP mRNA相对定量表达显著高于空白组(P＜0.01)，说明模型组APP mRNA表达上调;西对组、地黄饮子脑脊液组与模型组比较APP mRNA相对定量表达降低(P＜0.05或P＜0.01)，说明地黄饮子含药脑脊液能够下调受损PC12细胞APP mRNA的表达，起到保护细胞的作用。

3 讨论

Aβ的产生、积聚增加是引起神经元退化和死亡的主要机制，它是老年斑的核心成分，也是老年性痴呆发生的主要原因［7－8］。β－淀粉样蛋白沉积数量的多寡与疾病的严重程度呈正相关［9－10］。Aβ蛋白来源于其前体APP，由于神经细胞膜的损伤和APP异常过程的结果而形成［11］，APP基因的点突变、代谢异常及过度表达均可引起的Aβ聚集。所以AD防治的战略重点即为干预打断其恶性循环中的任何一个环节。

地黄饮子用于治疗肾气虚弱，语声不出，足痿不用的喑痱证。我们已应用地黄饮子治疗老年性痴呆的病机做了相关的实验研究［12－14］。本研究采用 Aβ25－35损伤PC12细胞的AD模型，通过FQ－PCR方法检测地黄饮子脑脊液对损伤细胞APP mRNA的影响。结果显示:模型组细胞APP mRNA相对定量表达上调，与空白组比较有显著性差异(P＜0.01)。加入含地黄饮子脑脊液后APP mRNA的表达显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。说明地黄饮子在核酸水平降低APP酶的表达，作用于β－AP的前体蛋白环节，从而减少β－AP的沉积，这可能是地黄饮子抗老年性痴呆的机制之一。

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