头风宁滴丸中菊花的精制工艺研究Δ

朱怡洁，何伟，伍振峰（1.广东药学院药物研究所/广东省药物新剂型重点实验室，广州市510006；.江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室，南昌市 330004）

头风宁滴丸处方由菊花、川芎、白芷等药味组成，具有平肝活血、通络止痛之功效，用于治疗偏头痛肝风挟瘀证。菊花为方中君药，取其药性升浮、轻清、清香之气，升发清阳直达颠顶，使浊气自降而头痛自解[1]。原方以煎剂为用，后根据临床用药的特点和药物理化性质、药理作用，研制成滴丸，由于滴丸载药量较小，须对处方药物进行提取纯化后方能成型。菊花中主要成分为绿原酸、黄酮类和挥发油等化合物[2]。本试验以绿原酸比吸附量、洗脱率为评价指标，采用大孔吸附树脂对菊花提取液进行精制，考察了树脂种类、上样量、上样浓度、洗脱溶剂种类与用量等精制工艺参数。

1 仪器与试药

ultimate 3000高效液相色谱（HPLC）仪（美国Dionex公司）；AB-8、X-5、NKA-9型大孔树脂（天津南开大学化工厂）；HPD100、HPD400、HPD600、HPD200A、D101型大孔树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）。

菊花购自广州致信药业有限公司，经广东药学院生药学教研室刘基柱副教授鉴定为菊科植物菊ChrysanthemummorifaliumRamat.的干燥头状花序；绿原酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：0753-200111）；甲醇、乙腈为色谱纯，水为屈臣氏蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 绿原酸含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品0.010 06 g，置10 mL量瓶中，加乙醇溶解并定容，作为对照品贮备液。吸取对照品贮备液1 mL，置10 mL量瓶中，加乙醇溶解并定容，制成每1 mL含绿原酸0.100 6 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密吸取样品溶液20 mL，水浴蒸干，残渣加50%乙醇使溶解，并定容至10 mL量瓶中，作为供试品溶液。

2.1.3 色谱条件色谱柱：DIONEXAcclaim 120 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液（12∶88）；检测波长：328 nm；流速：1.0 mL·min-1。在此条件下，供试品中绿原酸与其他组分峰能达到基线分离，保留时间为8.3 min。

2.1.4 标准曲线的制备 分别精密吸取对照品溶液1、3、5、10、15、20 μL，注入液相色谱仪中，测定绿原酸色谱峰面积。以绿原酸峰面积积分值（Y）为纵坐标，进样量（X）为横坐标，进行线性回归，得回归方程为Y＝46.282 7X+0.892 8（r＝0.999 9）。结果表明，绿原酸进样量在0.100 6～2.012 μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.1.5 含量测定 分别吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪中，照“2.1.3”项下色谱条件测定绿原酸色谱峰面积，计算绿原酸含量。

2.2 大孔吸附树脂精制工艺考察

2.2.1 样品溶液的制备 取菊花药材150 g，加8倍量水回流提取3次，每次1 h，合并提取液，滤过，减压回收，离心处理（5 000 r·min-1）20 min，定容至1 000 mL，作为样品溶液（每1 g生药含绿原酸2.244 mg）。

2.2.2 树脂种类的筛选 以绿原酸比吸附量、洗脱率为指标，对HPD100、HPD200A、HPD400、D101、X-5、HPD600、NKA-9、AB-8型大孔吸附树脂进行选择。

分别量取处理后的各型大孔吸附树脂各10 mL，湿法装柱（内径1 cm，长10 cm，下述装柱条件均与此相同），水洗至无醇味。取样品溶液200 mL上柱，使其超载，用水90 mL洗至流出液近无色，流出液定容至100 mL，作为样品溶液Ⅰ。再用70%乙醇90 mL洗脱，洗脱液定容至100 mL，作为样品溶液Ⅱ。分别吸取样品溶液Ⅰ、Ⅱ，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.1.5”项下方法测定绿原酸含量，按下式计算绿原酸比吸附量、洗脱率：比吸附量＝（上柱前药液中总量－吸附残液中含量）（mg）/树脂体积（mL）；洗脱率＝醇洗脱液中含量/（上柱前药液中总量－吸附残液中含量）×100%。结果，HPD600型大孔吸附树脂比吸附量为2.86 mg/mL树脂，洗脱率为90.5%，均高于其他树脂，故选择HPD600型大孔吸附树脂。树脂优选比吸附量、洗脱率结果见表1。

表1 树脂优选比吸附量、洗脱率结果Tab1 Adsorption quantity and elution rate of chlorogenic acid with different macroporous adsorption resin

2.2.3 大孔吸附树脂吸附条件考察 （1）泄露曲线考察：精密量取样品溶液100 mL，通过大孔吸附树脂柱，水洗至近无色，分段收集流出液，每次10 mL，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液Ⅰ～Ⅹ，照“2.1.5”项下方法测定绿原酸色谱峰面积，计算绿原酸含量，以供试品编号为横坐标，绿原酸质量（mg）为纵坐标，绘制泄漏曲线（见图1）。结果显示，当通过树脂柱的样品溶液达80 mL时，大孔吸附树脂对绿原酸的吸附基本达到饱和。为使绿原酸保留完全，以80 mL作为最大上样量，即为1.2 g（生药）/mL树脂。（2）样品溶液浓度考察：精密量取样品溶液适量，分别调节其浓度以菊花药材计0.15、0.075、0.037 5 g·mL-1，各精密量取100、200、400 mL通过大孔吸附树脂柱，水洗至流出液近无色，收集流出液，定容，作为样品溶液Ⅰ-1、Ⅰ-2、Ⅰ-3；继以70%乙醇100 mL洗至洗脱液近无色，收集洗脱液，定容，作为样品溶液Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3。分别取上述样品溶液，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.1.5”项下方法测定绿原酸色谱峰面积，计算绿原酸含量、比吸附量和洗脱率。结果，上样浓度为0.075 mg·mL-1时，比吸附量和洗脱率最高。样品溶液浓度考察结果见表2。

图1 绿原酸泄漏曲线Fig1 Leaking curve of chlorogenic acid

表2 样品溶液浓度考察结果Tab2 The investigation result of the concentration of physic liquor

2.2.4 大孔吸附树脂洗脱条件考察 （1）洗脱剂浓度选择：精密量取0.075 mg·mL-1样品溶液80 mL通过树脂柱，水洗至近无色，分别以2倍柱体积的30%、50%、70%、90%乙醇洗脱同一树脂柱，收集洗脱液，每20 mL为1份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.1.5”项下方法测定绿原酸色谱峰面积，计算绿原酸含量。结果，70%乙醇洗脱效果较佳，可洗脱99%以上的绿原酸，故确定以70%乙醇为洗脱剂。（2）洗脱剂用量考察：按上述优选条件，精密量取样品溶液通过树脂柱，水洗至近无色，用70%乙醇洗脱，洗脱液以20 mL为单位收集，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.1.5”项下方法测定测定绿原酸含量。结果，4倍树脂体积的洗脱剂洗脱率可达97%以上，故洗脱剂用量确定为4倍树脂体积。

经以上试验确定，大孔树脂精制工艺条件为菊花提取液离心预处理（5 000 r·min-1）20 min后的药液作为样品溶液，调节样品溶液浓度为0.075 g·mL-1（以菊花药材计），最大上样量为1.2 g（生药）/mL树脂，通过HPD600型大孔吸附树脂，水洗至流出液近无色，继以70%乙醇4倍树脂体积洗脱，收集洗脱液。

以优选工艺条件进行中试放大试验，大孔吸附树脂精制后10批样品中绿原酸的平均洗脱率为86.85%，证实所选工艺合理可行。

3 讨论

由于提取液中所含杂质会阻塞大孔吸附树脂，降低其吸附作用，故在过柱前要进行药液的预处理。笔者考察了滤过法、离心法（5 000 r·min-1，20 min）和醇沉法（ρ＝1.05，醇浓度50%），结果显示，离心法绿原酸损失最小，药液澄明度好，故选择离心法进行药液预处理。

试验中还考察了药液pH值和盐浓度对绿原酸比吸附量和洗脱率的影响。结果显示，在一定pH范围内，不同pH样品溶液的比吸附量、洗脱率没有明显差异；其比吸附量、洗脱率随盐浓度的增加而减少，故选择原液上样。

大孔吸附树脂纯化效果受树脂结构、吸附或洗脱条件及被分离物质结构等因素的影响，树脂纯化中可能发生活性成分的质与量的变化。因此，笔者分析比较了大孔吸附树脂纯化前后提取物的HPLC图谱，并通过分析各组分峰的紫外吸收曲线考察纯化效果。结果显示，树脂纯化前后图谱中相关活性成分峰的紫外吸收行为一致。

综上所述，优选工艺似能较好地纯化富集绿原酸，达到“去粗存精”的纯化效果。

[1]吴凡伟，叶春燕.加味散偏汤联合酚咖片治疗偏头痛30例[J].吉林中医药，2010，30（6）：495.

[2]于红宇，李艳卿，陈历雄.杭白菊药液大孔树脂精制工艺研究[J].中药材，2009，32（7）：1 125.