衍生化HPLC法测定双氢睾酮制剂中的药物含量*

聂 阳，陈辉芳，朱俊访，李 博，刘亚娟，丁 立

(1 广东食品药品职业学院制药工程学院，广东 广州 510520；2 广东岭南职业技术学院药学院，广东 广州 510663；3 广东食品药品职业学院实验实训中心，广东 广州 510520)

双氢睾酮(Dihydrotestosterone)是一种由人体自然产生的雄性激素，广泛分布于全身血液当中，可促进男性生殖系统的正常发育，对于第二性征的出现和维持有积极作用，临床上主要用于5α-还原酶缺陷所致性分化异常，鉴别诊断良性前列腺疾病[1-2]。目前，国内报道的双氢睾酮测定方法有两种：放射/酶联免疫法、质谱联用法，前者主要用于人体组织及体液临床检测，后者样品处理繁琐、检测费用高昂[3-5]。双氢睾酮双氢睾亦称17β-羟基-5α-雄[甾]烷-3-酮，因其化学结构中无可产生紫外吸收的生色基团，无法采用常规的HPLC法测定，因此，国内无双氢睾酮及制剂的HPLC测定方法报道。

衍生化技术利用衍生化反应使药物与衍生化试剂生成衍生物，以改变待测物的化学和物理性质，使其具有对紫外和荧光检测器有响应的官能团，则可以大大提高HPLC的检测灵敏度和检测范围[6-7]。本研究基于双氢睾酮的羟基与对硝基苯甲酰氯快速衍生化反应，反应产物产生明显的紫外吸收，建立衍生化HPLC测定双氢睾酮方法。本法灵敏度高，干扰少而选择性强，是双氢睾酮及其制剂质量控制的一个好方法。

1 仪器与试剂

1.1 仪 器

Agilent 1200 HPLC，配自动进样器和 DAD二极管矩阵检测器，美国安捷伦公司；Sartorious BS-224S电子天平，北京赛多利斯天平有限公司；JY92-2D超声波清洗机，宁波新芝生物科技有限公司；SH23-2恒温磁力搅拌器，上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司。

1.2 试 剂

双氢睾酮原料(含量>99.1%)，山东铂源药业有限公司；双氢睾酮制剂(凝胶、乳膏、粉针剂)实验室自制；对硝基苯甲酰氯，山西西亚化工科技有限公司；乙腈为色谱纯，美国Tedia公司；二氯甲烷、吡啶、乙酸乙酯、无水乙醇、甲醇均为分析纯，阿拉丁试剂有限公司；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX StableBond-C18柱(4.4 mm×250 mm,5 μm)；流动相：甲醇-0.2%三乙胺水(95:5)；柱温：25 ℃：流速：1.0 mL·min-1；检测波长：254 nm；进样量: 20 μL。

2.2 标准液的配制

精密称取双氢睾酮原料10.30 mg，加甲醇25 mL溶解，得浓度为412.00 μg/mL双氢睾酮储备液。取双氢睾酮储备液加甲醇稀释，制得不同浓度的标准液。

2.3 衍生化反应条件

称取样品溶液适量置于25 mL具塞圆底烧瓶中，用二氯甲烷-吡啶(5:1) 5mL溶解，加入对硝基苯甲酰氯0.20 g密闭，超声30 min，静置2 h，加水5 mL，超声30 min，转移至分液漏斗中，静置1 d，取下层清液，通过大孔吸附树脂柱(20 cm×2.0 cm)以70%乙醇300 mL洗脱，继以无水乙醇400 mL洗脱，收集无水乙醇洗脱液，蒸干，用甲醇溶解，定容至10 mL，备用。

2.4 供试品溶液的配制

精密称取双氢睾酮制剂约2 g，以乙酸乙酯30 mL回流提取2 h，挥尽乙酸乙酯后，取滤渣置锥形瓶中，加入甲醇20 mL，超声提取60 min，过滤，取滤液，挥干，将残渣按“2.3衍生化反应条件”进行衍生化反应，用甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，定容至刻度，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液20 μL，得供试品溶液。

2.5 系统适应性

按“2.2标准液的配制”项下操作，但不加双氢睾酮原料，再按“2.4供试品溶液的配制”项下操作，且不加对硝基苯甲酰氯，得阴性对照液。按“2.2标准液的配制”项下操作，得双氢睾酮标准液。按“2.2标准液的配制”项下操作，再按“2.4供试品溶液的配制”项下操作，得双氢睾酮标准液衍生物。按“2.4供试品溶液的配制”项下操作，得双氢睾酮凝胶衍生物。

取阴性对照液、双氢睾酮标准液、双氢睾酮标准品衍生化物和双氢睾酮凝胶衍生化物进液相按“2.1色谱条件”项下测定，HPLC色谱图见图1。在此色谱条件下，对照品和样品中其他组分可基线分离，与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数计算不低于3000。

图1 阴性对照液(A)、双氢睾酮标准液(B)、双氢睾酮标准品衍生化物(C)和双氢睾酮凝胶衍生化物(D)HPLC图

2.6 线性关系考察

精密移取双氢睾酮储备液0.5、1、2、3、1、2 mL，置50、50、50、50、10、10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，制备成浓度依次为4.12、8.24、12.36、24.76、41.20和82.40 μg·mL-1系列标准品溶液，按“2.4 供试品溶液的配制”项方法处理样品，吸取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图和峰面积。以峰面积Y对质量浓度X(μg·mL-1)进行线性回归计算，得双氢睾酮的线性回归方程分别为: Y=84517X- 29.878,r=0.9997。结果表明，双氢睾酮在4.12～82.40 μg·mL-1范围内，其浓度与峰面积呈良好线性关系。.

2.7 精密度试验

取同一标准品溶液，按“2.4供试品溶液的配制”项方法处理样品，进液相色谱仪测定，重复进样6次，计算双氢睾酮峰面积的RSD为0.89%，表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验

取同一批的双氢睾酮凝胶，按“2.4供试品溶液的配制”项方法处理样品，平行制备6份样品，吸取20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图和峰面积计算含量。结果双氢睾酮的平均含量为24.7276 mg/g，RSD分别为1.55%，表明方法重复性良好。

2.9 稳定性考察

精密吸取同一批双氢睾酮凝胶供试品溶液20 μL，分别于0、2、4、8、12、16、24 h取样测定，计算双氢睾酮峰面积的RSD为1.18%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.10 加样回收率试验

精密称取双氢睾酮原料1.2012 g，加乙腈溶解，定容至50 mL，得浓度为24.024 mg·mL-1双氢睾酮高浓度溶液。取已知含量的同一批双氢睾酮凝胶，分别精密加入一定量的双氢睾酮高浓度溶液，按“2.4供试品溶液的配制”项方法处理样品，进液相测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收试验结果

3 双氢睾酮制剂含量测定

分别取3种双氢睾酮制剂各3批，按按“2.4供试品溶液的配制”项方法处理样品，精密吸取供试品溶液20 μL，注入液相色谱仪，计算含量，结果见表2。

表2 双氢睾酮制剂中药物含量测定结果(n=3)

4 讨 论

4.1 色谱条件的选择

本实验采用衍生化HPLC法，对双氢睾酮分子的羟基进行苯甲酰化反应，使最大吸收波长移至254 nm处；对流动相所用的比例进行系列试验，结果表明甲醇-0.2%三乙胺水为95:5时峰形最佳。对照品、供试品在本文色谱条件下均无杂峰干扰，提高了分离选择性和检测灵敏度，实现了对样品中干扰物质的分离和双氢睾酮的定量分析。

4.2 衍生化方法的优化

以苯甲酰卤作为衍生化试剂，应用于衍生化HPLC法在药物的含量测定中已有广泛应用[8-9]。本方法采用对硝基苯甲酰氯为衍生化试剂，从衍生剂与样品反应的最适浓度、反应温度、衍生反应时间、样品萃取、大孔树脂洗脱方法等，进行了衍生化方法的全面优化，建立了衍生化HPLC对双氢睾酮制剂中药物含量测定方法。

4.3 样品的提取

在样品提取上，对乙酸乙酯回流法、水煎醇沉法和超声提取法进行了比较。结果表明，回流提取法所测得双氢睾酮的含量明显高于超声提取和水煎醇沉法。对回流法的提取时间和温度进行了考察，确定2 h为最佳提取时间。提取温度在70～80 ℃时，提取率无明显变化。

5 结 论

实验结果表明，该方法快速、灵敏、准确，各项技术指标符合有关标准的规定。本研究建立的衍生化反应条件温和，产物稳定，样品进样前处理简单，可用于双氢睾酮的定量分析，为双氢睾酮制剂的质量控制提供依据，也可为其他类似物质的衍生检测提供参考。