激活瞬时受体电位香草醛亚家族1抑制RhoA/Rho激酶改善高脂介导的血管舒张功能异常

朱振宇,张莉莉,王沛坚,马丽群,王利娟,刘道燕,祝之明

第三军医大学全军高血压代谢病中心 重庆大坪医院高血压内分泌科 重庆市高血压研究所,重庆 400042

高血压是影响人类健康的重大慢性疾病,也是脑卒中、冠心病和心肾功能衰竭的主要原因,其发病与遗传因素和环境因素共同作用有关[1]。流行病学研究表明,多种饮食因素,如:膳食高脂、钠和钾的含量,均可影响血压[2]。瞬时受体电位通道香草醛类受体1型 (transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1),也称为辣椒素受体,在心血管代谢疾病中的作用近年来颇受关注[3-4]。本课题组最近研究发现,膳食辣椒素能够激活血管内皮TRPV1,促进eNOS/NO通路,降低自发性高血压大鼠的血压[5];激活TRPV1能够减轻高盐摄入诱导的氧化应激,减少超氧阴离子的产生,提高NO的生物利用度,从而改善高盐膳食导致的内皮依赖性舒张功能障碍及降低高盐摄入导致的血压升高[6]。激活TRPV1改善血管功能除与内皮功能改善[5]外,是否还涉及其他机制,如电压依赖的钾通道,值得进一步探讨。

Rho是哺乳类动物Ras基因超家族的一个亚群,被称为小GTP结合蛋白。Rho主要作用是调节细胞内肌动蛋白骨架,与细胞的变形、运动、细胞分裂等有关,也参与平滑肌收缩过程中对钙敏感性的调节[7]。已有研究提示,RhoA和Rho激酶 (Rock)信号通路的激活可导致血管平滑肌收缩,血管张力增加,进而引起血压升高[8];应用RhoA/Rho激酶的抑制剂能够降低血压。本课题组既往研究显示,噻嗪类利尿剂的抗高血压机制也与抑制RhoA/Rho激酶信号通路有关[9]。但激活TRPV1是否影响RhoA/Rho激酶信号通路并不清楚。本研究主要探讨激活TRPV1对于高脂饮食介导的血管功能异常的影响,以及钾通道和RhoA/Rho激酶在其中的作用。

材料和方法

动物及分组 雄性10周龄C57BL/6J小鼠80只,体重21～22 g,由第三军医大学附属大坪医院实验动物中心提供;采用随机表法分为普通饮食组、普通饮食 +辣椒素组、高脂饮食组、高脂饮食 +辣椒素组4组,每组20只。辣椒素添加浓度为0.01%。小鼠分笼,自由进食饮水。自然昼夜采光,室温22～24℃,每日早晚喂食、换水。

主要试剂和仪器 鼠尾血压测量仪(Powerlab2/25,澳大利亚ADI公司),小血管张力测定仪 (Multi wire myograph system,丹麦DMT公司),多导生理记录仪(Powerlab/8SP,ADI,澳大利亚ADI公司),全自动生化分析仪 (Beckman Coulter Synchron Lx20,美国Bio-Rad公司),PCR仪 (PTC-200,美国GENE公司),凝胶扫描成像系统 (Gel Doc 2000,美国Bio-Rad公司),比率荧光成像系统 (PTI104B,美国PTI公司),倒置荧光显微镜 (TE2000-U,日本NIKON公司)。辣椒素、辣椒卓平、Fura-2/AM、Pluronic F-127(美国Sigma公司),α-actin抗体、β-actin抗体、抗TRPV1抗体、抗Kv1.4抗体、抗RhoA抗体、抗Rock1抗体 (美国Santa Cruze公司)。

平滑肌细胞的培养和鉴定 采用组织块贴壁法原代培养平滑肌细胞:C57BL/6J小鼠腹腔注射10%乌拉坦麻醉,分离并取出胸主动脉,显微镜下迅速除去脂肪和结缔组织,PBS清洗3次,除去内外膜,将中膜剪成1 mm×1 mm大小组织块,移入25 ml培养瓶中,用尖嘴弯管均匀贴好组织块,放入37℃、5%CO2培养箱中倒置培养3 h,组织块贴壁后,加入2.5 ml含10%小牛血清的DMEM中,放回培养箱中,3 d后可见组织块周围有细胞长出,培养2周后可观察到长满的平滑肌细胞。传代3次分离的细胞用 α-actin抗体通过免疫组织化学法染色鉴定为平滑肌细胞。

RT-PCR 按照文献 [10]所述方法提取平滑肌细胞 RNA。TRPV1引物序列为:上游:5′-TGCCCTATCATCACCGTCAG-3′, 下 游:5′-CAGTGCCATGTTCCGCCTTT-3′。PCR反应条件为:94℃预变性5 min,94℃变性40 s,65℃退火30 s,72℃延伸40 s,循环35次,72℃再延伸10 min,取出反应管置4℃10 min。产物经琼脂糖凝胶电泳,紫外荧光灯下观察,凝胶成像系统扫描。

平滑肌细胞中TRPV1表达的免疫组织化学法检测 传代3次分离的原代平滑肌细胞接种于无菌盖片上,甲醛固定,双氧水甲醇溶液去除内源性过氧化物,蒸馏水清洗后5%BSA封闭液封闭,加1∶100稀释的一抗 (TRPV1抗体)孵育,4℃过夜。阴性对照滴加相应剂量PBS;PBS清洗,滴加IgG,PBS清洗,滴加SABC,PBS清洗,DAB显色;苏木素复染,清水洗涤;晾干,封片,TE2000-U倒置荧光显微镜下观察,结合NIS-Elements成像软件照相。

血管钙信号测定 分离肠系膜动脉一级分支,置于6孔板中,每孔加入1 ml生理盐溶液 (physiological saline solution,PSS) 并 加 入 4μmol/L Fura-2/AM和0.02%Pluronic F-127,置37℃孵箱中避光孵育1 h,取出血管置于2 cm ×2 cm玻片上,用PSS液冲洗血管3次,去除细胞外残余的Fura-2/AM;将负载Fura-2/AM的肠系膜动脉置于荧光显微镜下(PTI104B),钙荧光的激发波长为340 nm/380 nm,发射波长为510 nm;荧光信号经Felix专用软件处理。以游离钙与结合钙荧光强度之比Ratio(即在波长为510 nm的紫外光发射情况下,340 nm/380 nm之紫外光强度之比,前者代表游离钙,后者代表结合钙)反映血管钙信号的变化,Ratio曲线升高表明游离钙升高。先测定基础状况下血管Ratio曲线情况,然后观察并记录在300 s内不同浓度辣椒素刺激下各组血管引起的Ratio曲线改变,计算Ratio曲线的升高幅度 [升高幅度 =(最高值-基础值)/基础值 ×100%]。

鼠尾血压测量 采用无创方法,通过鼠尾血压测量仪 (Powerlab2/25澳大利亚)测定小鼠清醒、安静状态下鼠尾血压,分别在干预开始时和干预后每4周测定。

血管环实验 C57BL/6J小鼠用10%乌拉坦腹腔注射麻醉后,取出胸主动脉,显微镜下清除血管周围脂肪和结缔组织。制备长约2.5 mm的血管环,直径40μm的不锈钢丝悬挂血管环于小血管张力测定仪的浴槽中,持续通入95%O2和5%CO2混合气体,37℃孵育。调节初张力,待张力曲线稳定后,加入60 mmol/L的KCl,观察血管环对KCl的收缩反应。更换血管环液,加入去甲肾上腺素 (norepinephrine,NE)(10-7mol/L)刺激血管环收缩,待达稳定收缩平台后加入乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)(10-6mol/L),观察血管环在NE诱发的收缩状态下对内皮依赖性舒张药物ACh的反应;更换血管环液,加入 NE(10-7mol/L)刺激血管环收缩,待达稳定收缩平台后加入硝酸甘油 (nitroglycerin,NTG)(10-7mol/L),观察血管环在NE诱发的收缩状态下对非内皮依赖性舒张药物NTG的反应。血管收缩反应的大小以NE(10-7mol/L)所致收缩幅值 (峰值-基础值)占KCl(60 mmol/L)所致收缩幅值的百分比表示。舒张反应大小则以舒张幅值 (峰值-最低值)占10-7mol/L NE所致收缩幅比值表示,其中内皮依赖的舒张反应以ACh(10-6mol/L)所致舒张幅值占10-7mol/L NE所致收缩幅值之比表示;非内皮依赖的舒张反应以NTG(10-7mol/L)所致舒张幅值占NE所致收缩幅值之比表示。

蛋白表达检测 采用Western blot法检测主动脉中目的蛋白的表达:取100 mg小鼠主动脉组织加入适量预冷的RIPA裂解液 (蛋白质匀浆缓冲液1 ml加 PMSF 50μg,Leuptin 5μg) 裂解 组织 , 提 取总 蛋白,Beckman紫外分光光度仪测定蛋白浓度。蛋白上样量50μg,经 SDS-PAGE电泳转移至 PVDF膜上,封闭后加入一抗 (1∶1000 TRPV1、Kv1.4、RhoA、Rock1抗体),二抗 (1∶2000对应二抗),进行抗原抗体反应,化学发光试剂增强反应,X线片压片曝光,凝胶成像系统分析结果。

结 果

TRPV1在血管平滑肌细胞的表达 RT-PCR检测结果显示,培养的血管平滑肌细胞中有TRPV1 mRNA表达,PCR产物长度约435 kb(图1A);Western blot检测结果显示,血管平滑肌细胞中有TRPV1蛋白表达,其相对分子质量约为95000(图1B);采用TRPV1抗体进行的免疫组织化学染色结果证实,培养的血管平滑肌细胞中有较多的TRPV1分布 (图2)。

激活TRPV1对血管钙信号的影响 采用不同浓度辣椒素刺激肠系膜动脉后,结果显示随着辣椒素浓度的增加,[Ca2+]i的升高幅度明显增加,对辣椒素刺激呈浓度依赖性反应 (P＜0.05)(图3A)。预先用 TRPV1的拮抗剂辣椒卓平 (1μmol/L)孵育血管5 min,结果显示辣椒素 (1μmol/L)诱导的 [Ca2+]i升高幅度明显降低 (P＜0.05)(图3B)。

激活TRPV1对血管反应性的作用 高脂饮食组内皮依赖和非内皮依赖的舒张反应分别为 (26±12)%和 (18.9±13.0)%,均明显低于普通饮食组的100%和100%(P均 ＜0.01)。高脂饮食 +辣椒素组的内皮依赖和非内皮依赖的舒张反应分别为(69±15)%和 (46.5±6.0)%,均明显高于高脂饮食组 (P均 ＜0.05),但仍明显低于普通饮食组 (P＜0.05,P＜0.01);各组间的收缩反应差异均无统计学意义 (P均 ＞0.05)。

图1 TRPV1在C57BL/6J小鼠VSMC中的表达Fig 1 Expression of TRPV1 in the VSMC of C57BL/6J mice

图2 原代培养C57BL/6J小鼠VSMC的 α-actin和TRPV1免疫组织化学染色Fig 2 α-actin and TRPV1 immunohistochemistry in primary cultured VSMC of C57BL/6J mice

图3 辣椒素激活TRPV1对C57BL/6J小鼠肠系膜动脉 [Ca2+]i的影响 (n=5)Fig 3 Dietary capsaicin-activated TRPV1 on[Ca2+]i of mesenteric artery in C57BL/6J mice (n=5)

激活TRPV1对血压的作用 高脂饮食组大鼠的血压为 (134.75±6.85)mmHg,明显高于普通饮食组的 (115.667±4.69)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)(P＜0.05);高脂饮食 +辣椒素组大鼠的血压为(130.25±3.77)mmHg,与高脂饮食组大鼠差异无统计学意义 (P＞0.05)。

激活TRPV1对血管钾通道和RhoA/Rho激酶表达的影响 Western blot检测结果显示,普通饮食 +辣椒素组大鼠的Kv1.4蛋白表达明显高于普通饮食组 (P＜0.05),高脂饮食 +辣椒素组大鼠的Kv1.4蛋白表达明显高于高脂饮食组 (P＜0.05);高脂饮食组大鼠RhoA和Rho激酶蛋白的表达明显高于普通饮食组 (P＜0.05),普通饮食 +辣椒素组明显低于普通饮食组 (P＜0.05),高脂饮食 +辣椒素组明显低于高脂饮食组 (P＜0.05)(图4)。

讨 论

高血压及其血管功能异常还涉及钾通道功能异常与血管钙的敏感性失调[11-12]。近年研究表明,分子鸟苷酸结合蛋白,即小G蛋白,RhoA及其Rho激酶在血管钙敏感性调节中发挥重要作用,并参与高血压的病理生理过程。有报道在L-NAME诱导的高血压模型中,主动脉RhoA/Rho激酶的活性均升高,给予Rho激酶抑制剂可降低血压。同时,血管紧张素Ⅱ受体阻断剂可以抑制L-NAME诱导的高血压动物的主动脉RhoA/Rho激酶的高表达[13]。Denniss等[14]研究提示,遗传性高血压大鼠 (spontaneously hypertensive rat,SHR)的血管RhoA/Rho激酶活性升高,给予RhoA/Rho激酶抑制剂法舒地尔干预后,可以降低SHR的血压,但是对于正常血压的WKY大鼠则没有降低作用[15]。本研究结果显示,高脂饮食可导致小鼠血管舒张功能异常及血压升高,RhoA/Rho激酶的表达显著增加,提示高脂诱导的血压升高可能与RhoA/Rho激酶通路的激活有关。

高血压及血管损害的防治除应用各种降压调脂药以外,生活方式改变,如健康膳食发挥着重要作用。有研究证实,膳食辣椒素对心血管代谢有保护作用[16],有关辣椒素作用其靶点TRPV1参与血管功能和血压的调控已被许多研究证实。本研究结果显示,小鼠血管上存在TRPV1表达及分布,并可被辣椒素激活。长期给予辣椒素干预后,血管的内皮依赖及非依赖的舒张功能均得到改善。有报道激活血管TRPV1除可导致内皮依赖的血管舒张外[5],还激活钾通道[17]。本研究结果显示,辣椒素饮食干预组的钾通道蛋白表达升高,由于钾离子通道的内向电流作用对细胞钙有一定依赖性[18],因此辣椒素激活TRPV1介导的钙信号可能对激活钾通道有一定作用。有报道显示,特异性阻断钾通道功能可增加小鼠大小血管的Rho激酶活性[19]。本研究结果发现,辣椒素干预组小鼠血管的RhoA/Rho激酶蛋白表达明显降低,提示辣椒素激活TRPV1上调钾通道也可能与其抑制RhoA/Rho激酶有关。

图4 各组大鼠Kv 1.4、RhoA和Rho激酶蛋白表达的比较 (n=3)Fig 4 Comparison of the expressions of Kv 1.4,RhoA,and Rho kinase protein among all groups(n=3)

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