CD14mRNA的表达在急性脑出血肠-肝轴紊乱中的作用及星蒌承气汤的干预研究

赵海滨，唐杰，马立华，王威，王帅，张秀静

急性脑出血是神经系统多发病和常见病，可引起一系列内分泌功能紊乱，严重可导致全身炎症反应综合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome,SIRS)，或多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)。急性脑出血时，肠黏膜屏障受损，通透性增加，细菌易位，形成肠源性内毒素血症，最终导致肝损害；随着肝损害的进一步加重，肝脏对内毒素清除能力下降，加重内毒素血症。两者互为因果，恶性循环。脑出血急性期多表现为“痰热腑实证”，发在颅内(上)，治在胃肠(下)，清热通腑化痰是临床常用治法。本研究旨在既往急性脑出血模型研究的基础上，阐述肝、肠系膜淋巴结CD14表达的动态变化在急性脑出血应激性肝损害中的作用及星蒌承气汤的干预效应。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 成年健康雄性SD大鼠88只，体重(220±20)g，由北京中医药大学实验动物中心提供。采用随机数字表法将大鼠分为正常组(A组，n=24)、单纯脑出血组(B组，n=24)、脑出血痰热腑实证组(C组，n=24)和星蒌承气汤组(D组，n=16)。其中A、B、C组分24 h、48 h、72 h 3个时间亚组，D组分48 h、72 h两个时间亚组，每个时间亚组各8只。

1.2 实验材料 星蒌承气汤颗粒剂由北京康仁堂中药有限公司提供；总RNA抽提试剂Trizol由Invitrogen公司提供，5×SYBR Green PCR Master Mix由AB Applied Biosystems公司提供；dNTP由Solarbio公司提供；OligodT、Rnasin、M-MLA由Promega公司提供；引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成；采用Agilent Technologies stratagene M×3000 P荧光定量仪。

1.3 方法

1.3.1 动物模型制作 A组：不予造模处理，正常饮食。B组：复制脑出血模型[1-2]。用1%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔麻醉，俯卧固定于动物头颅立体定位仪上。根据大鼠大脑立体定位图谱，调整立体定向仪使门齿沟平面比耳间线平面低2.4mm，此时前囟和后囟基本上在同一平面上；将头部背侧的鼠毛剪去，皮肤消毒后头皮丁字切开，暴露颅骨，取前囟为原点，向右3mm，向前0.1mm处用牙科钻钻一直径约lmm的圆孔，采用微量注射器沿钻孔方向垂直进针，深约6mm(为尾状核位置)，进针后缓慢注射Ⅶ型胶原酶/肝素钠/生理盐水溶液2μl(每μl含Ⅶ型胶原酶0.25 U及肝素2 U)，留针2min，缓慢退针，骨蜡封闭颅骨钻孔，消毒，缝合皮肤。C组：脑出血模型手术前2 d起，复制痰热腑实证模型[3-4]。用10%自体粪便1ml/100 g灌胃，每天1次，连续3d。D组：复制急性脑出血痰热腑实证模型，于脑出血造模手术前2 d以1.08ml/kg开始灌胃给予星蒌承气汤，每天1次，造模前2 h加灌1次，造模后每天灌胃1次，各时相点处死前2 h加灌1次。

术后见大鼠明显出现粪便干结、烦躁、鼻分泌物多、喉中痰鸣、肢体瘫痪等症状者为模型制备成功。A、B、C组分别于造模后24 h、48 h、72 h处死，D组于造模后48 h、72 h处死。

1.3.2 实时荧光定量PCR检测 检测肠系膜淋巴结A、B组各时间点及肝各组各时间点CD14mRNA表达水平。

1.3.2.1 肝、肠系膜淋巴结组织总RNA的提取 每组各时间活杀大鼠，1min内切取肝、肠系膜淋巴结组织，在冰块上切取50～100mg的肝、肠系膜淋巴结，采用Trizol提取组织的总RNA，操作按说明进行。所得RNAA260/A280＞1.8，并计算出RNA含量。

1.3.2.2 cDNA的合成 RNA样品取10μg，依次加入5×RT Buffer 5μl，Oligo(dT)1μl，dNTP 1μl，RNA-sin 1μl，M-MLA反转录酶1μl，无RNase水补足至总体积25μl。反应条件：42℃1 h；95℃ 15min，4℃10min。得RT终溶液即为cDNA溶液。

1.3.2.3 实时定量PCR 每种组织均以CD14和β-actin基因引物进行定量PCR反应，在96孔PCR板中进行。CD14引物：上游：5'-TTG TTG CTG TTG CCT TTG AC-3'，下游：5'-CGT GTC CAC ACG CTT TAG AA-3'，扩增产物长度为214 bp。β-actin引物：上游：5'-AGA TCC TGA CCG AGC GTG GC-3'，下游：5'-CCA GGG AGG AAG AGG ATG CG-3'，扩增产物长度为138 bp。每个PCR反应体系中含5×SYBR Green PCR Master Mix 12.5μl，DEPC 水 6.5μl，上下引物混合1μl，cDNA 5μl。PCR反应的条件95℃预变性10min；95℃变性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸20 s，共40个循环；β-actin共35个循环。

1.3.2.4 结果分析 实时荧光定量PCR产物利用Mxpro QPCR Software 4.10(For Mx3000P and Mx3005P QPCR Systems)系统进行统计分析，可观察扩增曲线，各组选取集中度较高的数据，对cDNA的含量进行定量分析，计算样本的ΔΔCt值，以2ΔΔCt表示样品中目的基因mRNA相对表达量。

1.3.3 病理形态学检查 于上述各时相点分别活杀大鼠，取肝右后叶组织，10%福尔马林固定，石蜡包埋后切片，常规HE染色，并在光镜下进行病理观察。

1.4 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件，所得数据均用(±s)表示，组间比较采用t检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR CD14mRNA标准曲线相关系数为0.993，说明定量结果准确，通过公式计算出扩增效率为1.083。每轮反应后溶解曲线呈单峰，说明扩增产物单一，未检测到二聚体及非特异性产物，排除了假阳性结果的可能。见图1、图2。实时荧光定量PCR检测结果显示，在急性脑出血24 h内肝肠CD14mRNA表达升高，48 h达高峰，72 h回落。肝脏CD14mRNA检测结果显示，B组各时间点CD14mRNA表达较同期A组均升高(P＜0.05)，D组各时间点CD14mRNA表达较同期C组均有所降低(P＜0.05)甚至接近正常；肠系膜淋巴结CD14mRNA检测结果显示，B组各时间点CD14mRNA表达较同期正常组A组均升高(P＜0.05)。见表1、表2。

2.2 肝组织病理学改变 A组：光镜下见肝小叶结构正常，无肝细胞变性坏死，肝细胞索排列整齐，肝窦及中央静脉无异常。见图3。C组：24 h组见肝组织小部分区域浊肿，肝血窦结构不清晰，小部分细胞核界限不清及胞浆气球样变(图4)；48 h组见肝细胞变性加重，浊肿及气球样变区域扩大，肝细胞界限不清，部分细胞核溶解消失及胞浆气球样变(图5)；72 h组见肝细胞变性进一步加重，肝细胞界限不清晰，大部分细胞核溶解消失，胞浆极度疏松，气球样变占据肝脏大部分区域(图6)。B组病理改变与C组大致相同(图略)。D组：48 h见肝细胞变性坏死有所减轻，大部分细胞核存在，细胞界限清晰，部分细胞呈浊肿现象(图7)；72 h组见肝脏组织结构较完整，绝大部分细胞核存在，细胞界限清晰，少数细胞呈浊肿现象(图8)。

图1 大鼠肝CD14mRNA溶解曲线图

图2 大鼠肠系膜淋巴结CD14mRNA溶解曲线图

图3 A组HE染色(20×)

图4 C组24 h HE染色(20×)

图5 C组48 h HE染色(20×)

图6 C组72 h HE染色(20×)

图7 D组48 h HE染色(20×)

图8 D组72 h HE染色(20×)

3 讨论

本研究发现，急性脑出血24 h肝、肠系膜淋巴结CD14mRNA表达升高，48 h达高峰。肠道是机体最大的细菌和内毒素贮库。正常情况下，由肠道细菌产生的内毒素大部分随粪便排出体外，小部分被肠道黏膜吸收，经门静脉达肝血窦，被肝脏枯否氏细胞通过吞饮作用而被清除[5]。急性脑出血后下丘脑功能紊乱，脑肠肽平衡失调，肠道屏障结构破坏，此外肠道缺血、缺氧还可使肠道内厌氧菌和兼性菌优势繁殖，使内毒素的生成增加[6-8]，细菌和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)大量易位，最终导致肠源性内毒素血症。CD14为LPS高亲和力受体，发生内毒素血症时，LPS与CD14相结合，LPS通过脂多糖-脂多糖结合蛋白-可溶性CD14(LPS-LBP-sCD14)三联复合物作用于Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)并激活髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)，活化的MyD88可结合白细胞介素-1受体相关激酶(Interleukin-1 receptor-associated kinase,IRAK)和白细胞介素-1受体相关激酶-2(Interleukin-1receptor-associatedkinase-2,IRAK-2)，然后作用于肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF6)，进一步激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和核因子-κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)信号转导通路[9]，介导增强免疫反应和炎症反应，从而造成肝损害。

表1 各组各时间点肝脏CD14mRNA实时荧光定量结果

表2 A、B组个时间点肠系膜淋巴结CD14mRNA表达

从肝CD14mRNA表达及组织病理学改变看，通过星蒌承气汤干预后，肝损害程度逐渐减轻。星蒌承气汤具有“泻下”排毒的作用，通过排出肠道积滞，使肠道内细菌和内毒素随肠内容物排出体外，减少肠源性内毒素的产生和吸收，减少细菌移位，起到“釜底抽薪”、荡涤肠道细菌的作用。另外，下调巨噬细胞活性，减少TNF-α等炎症细胞因子的产生和释放，调节促炎介质与抗炎介质间的平衡，抑制巨噬细胞的激活，阻滞局部的炎症因子前体释放，减轻全身炎症反应[10]。由此可见，星蒌承气汤可改善急性脑出血时大鼠肠道菌群失调及肠道通透性，降低血浆内毒素水平，改善肝脏病理改变，对肠-肝轴紊乱的生物学效应具有明显阻断作用，对急性脑出血时大鼠肝脏具有保护作用。

[1]Chen Z,Gao C,Hua Y,et al.Role of iron in brain injury after intraventricularhemorrhage [J].Stroke,2011,2,42(2):465-470.

[2]朱文焕,周岱.大鼠脑出血模型制备的体会[J].内蒙古民族大学学报,2009,15(5):13-14.

[3]刘红敏,华荣,林松俊,等.中风病痰热腑实证大鼠模型血浆CCK水平变化[J].河南中医学院学报,2006,21(4):11-13.

[4]刘淑霞,白雅,任惠锋,等.黄竹清脑颗粒对痰热腑实证脑出血大鼠IL-6、Na+-K+-ATP酶活性及脑含水量的影响[J].山西中医,2009,25(7):42-44.

[5]王春妍,杨世忠,江海艳.急性肝损伤大鼠肠源性内毒素血症形成机理及其作用的实验研究[J].临床肝胆病杂志,2007,23(2):109-111.

[6]Solaroglu I,Okutan O,Kaptanoglu E,et al.Increased xanthine oxidase activity after traumatic brain injury in rats[J].J Clin Neurosci,2005,12(3):273-275.

[7]Lu BY,Chang JY.Assay of disulfide oxidase and isomerase based on the model of hirudin folding[J].Anal Biochem,2005,339(l):94-103.

[8]Neal MD,Leaphart C,Levy R,et al.Enterocyle TLR4 mediates phago-cytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier[J].J Immunol,2006,176(5):3070-3079.

[9]杨一新,李桂源.LPS所介导的信号转导通路研究进展[J].中南大学学报(医学版),2006,31(1):141-145.

[10]周鹃,耿耘.大承气汤防治内毒素血症的研究概况[J].时珍国医国药,2009,20(9):2127-2128.