2009～2010年华南地区副猪嗜血杆菌分离株ERIC-PCR指纹图谱的鉴定和分析

张凌云,徐成刚,张 斌,张建民,郭莉莉,赵 静,周素明,廖 明

(1.华南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点开放实验室,广东广州510642;2.青海大学农牧学院,青海 西宁 810016)

副猪嗜血杆菌(HPS)是巴斯德杆菌科(Pasteurellaceae)嗜血杆菌属(Haemophilus)的一种猪的专性病原菌,可引起猪多发性浆膜炎、肺炎、关节炎和脑膜炎等疾病,又称猪格拉氏病[1]。随着世界养猪业的发展,该病已成为全球范围内影响养猪业的一种重要细菌性疾病。据Kielstein P(1992)报道,副猪嗜血杆菌存在15个血清型[1],除此之外,还存在很多血清型不定的菌株。由此可见,副猪嗜血杆菌菌株间的差异非常大,仅利用血清分型的手段不仅操作费时费力,而且不能满足目前广为流行的副猪嗜血杆菌病的流行病学研究的要求。现代分子生物学技术特别是PCR技术的产生,为细菌流行病学的研究带来了新的思路,它可对临床和环境分离菌株进行鉴定、遗传多样性分析及克隆传播的监测。目前,用于副猪嗜血杆菌的分型研究和流行病学调查的方法,有限制性内切酶指纹图谱[2]、限制性片段长度、多态性聚合酶链式反应[3]和肠杆菌基因间重复一致序列聚合酶链式反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR,ERIC-PCR)等[4-6]。

肠杆菌基因间重复一致序列聚合酶链式反应是根据不同的细菌基因组上的保守重复序列的数目和分布不同,而扩增出由一系列大小不同片段组成的DNA指纹图谱。该方法以细菌整个染色体为研究对象,能够在基因组水平上准确反映菌体之间的差异,具有便于操作、特异性强、实用等优点,因此也被应用于副猪嗜血杆菌的分子分型及流行病学的研究[4-6]。

本文采用ERIC-PCR方法以15株不同血清型的副猪嗜血杆菌标准菌株为参照,对2009～2010年间分离自华南地区的41株副猪嗜血杆菌分离株进行分子分型,以期了解近两年华南地区副猪嗜血杆菌流行菌株的遗传演化特性及流行特点,为华南地区副猪嗜血杆菌病的研究积累重要的流行病学资料,为更好地防控该病奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 41株副猪嗜血杆菌分离株分离自2009年和2010年华南地区33个疑似副猪嗜血杆菌病的猪群,由本实验室分离、鉴定和保存,15株参考株由华中农业大学陈焕春院士惠赠。本试验所有的副猪嗜血杆菌均利用加有20μg/m L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)(Sigma公司)和5%灭活新生牛血清的胰酪蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)(Oxoid)进行培养,含有5%CO2,37°C 培养 16～24 h。

1.2 方法

1.2.1 血清型鉴定 分离菌株的血清型根据Kielstein-Rapp-Gabrielson(KPG)方法[1]进行鉴定,即用参考菌株制备15个血清型的抗血清,并用琼脂扩散沉淀试验对41株分离株的血清型进行鉴定。

1.2.2 DNA制备 取副猪嗜血杆菌分别接种在加有20μg/m L NAD和5%灭活新生牛血清的TSA培养基上复苏,37℃含5%CO2的环境中过夜培养,收获菌体,用DNA少量提取试剂盒提取基因组DNA。

1.2.3 ERIC-PCR PCR 引 物 :ERIC-1R(5′-ATGTAAGCTCCTGGGGA TTCAC-3′),ERIC-2(5′-AAGTAAG TGACTGGGGTGAGCG-3′)参照文献设计[9],由上海英骏生物技术有限公司合成。

PCR反应体系:1μL Taq DNA聚合酶(Invitrogen),2.5μL 10×PCR Buffer,1μL dN TP,1 μL ERIC-1R,1 μL ERIC-2,200 ngDNA 模板 ,加无菌去离子水到25μL体系。同时以去离子水作模板设阴性对照。

PCR反应条件:95℃预变性3 min,94℃变性30 s,55℃复性 40 s,72℃延伸1.5 min,30个循环,最后72℃延伸10 min。

1.2.4 DNA指纹图谱的分析 ERIC指纹图谱用BioNumerics 5.1数据库软件处理,进行条带数目、亮度和聚类分析(UPGMA)后产生树状图。并用鉴别指数DI对结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 ERIC-PCR结果 15株副猪嗜血杆菌参考株ERIC-PCR结果见图1。从图中可以看出对15株副猪嗜血杆菌参考菌株进行ERIC-PCR扩增后,图谱条带清晰,经肉眼观察14型和15型似乎具有相同的指纹图谱,经 BioNumerics软件分析血清型1～15的参考菌株都具有各自特异的指纹图谱,且指纹图谱具有可重复性。

图1 副猪嗜血杆菌参考菌株指纹图谱

2.2 ERIC-PCR电泳图谱分类鉴定及聚类分析用BioNumerics5.1软件用对电泳图谱进行分类鉴定和聚类分析(UPGMA)后产生系统进化树状图(见表1、图2)。从结果可看出,56株菌的指纹图谱多态性较高,共产生41个ERIC基因型,占优势的ERIC基因型为 E28(4/56)、E19(4/56)和 E31(4/56)。其中15株参考菌株具有各自独特的指纹图谱,41株分离株产生了26种不同的指纹图。从图2可看出,56株副猪嗜血杆菌可聚集成A、B、C三个群,其中B群为优势群。血清型和ERIC基因型间没有必然的联系,但血清5型和血清12型的菌株有聚集的现象,集中在B群。

表156 株副猪嗜血杆菌血清型和ERIC分型

3 讨论

目前,我国副猪嗜血杆菌病的发病率以及该病带来的经济损失都呈上升趋势[7]。由于受到环境、药物及动物本身状态等因素的影响,副猪嗜血杆菌的遗传物质也发生了相应变化,产生了新的基因特征,使得副猪嗜血杆菌的指纹图谱呈现较高的多态性。为此,本文对华南地区2009～2010年分离的41株副猪嗜血杆菌和15株参考株的基因型进行了ERIC-PCR指纹图谱鉴定、比较和分析,拟确定华南地区近两年流行的ERIC基因型,以期了解华南地区副猪嗜血杆菌的流行情况和变化趋势。

从笔者对副猪嗜血杆菌ERIC指纹图谱的分析发现,41株分离株都具有特异的 ERIC指纹图谱,且应用血清学分型方法未能分型的 4株菌株(SC006、SC019、SC053、SC108),通过 ERIC-PCR方法均能分型,从而弥补了传统血清分型[1]方法的缺陷。

笔者认为ERIC-PCR分型方法、血清分型和流行病学资料相结合有利于对副猪嗜血杆菌进行流行病学研究。如19株来自广东三水地区的菌株可分为8个ERIC基因型和5个血清型,还有3株未被定为任一血清型。普遍流行的ERIC基因型有E28(4/19),E31(4/19),E19(3/19),且可看出该基因型的菌株有血清2、5、12、15型,这些血清型的菌株都被预测为具有强毒力或中等毒力,因此,推测E28、E31和E19基因型的菌株为广东三水地区发生格拉氏病的常见菌型。据此可有针对性地采取防控措施,防止副猪嗜血杆菌病的发生和病原的传播。本试验是继李鹏等[6].对2003～2008年部分地区分离的副猪嗜血杆菌ERIC基因分型的后续研究,以对近两年华南地区副猪嗜血杆菌流行菌株的情况进行及时监测,使副猪嗜血杆菌流行病学资料具有延续性。

本试验以生物学信息管理软件BioNumerics 5.1对生物学数据进行分析,通过辛普森多样性指数计算其鉴别能力得出,ERIC-PCR能够将遗传上不相关的副猪嗜血杆菌菌株鉴别开来,且具有较高的鉴别率,为0.984;高于在巴西[5]分离株分型运用中的0.960的鉴别率。此外,对来自5个猪场的13株副猪嗜血杆菌的基因相关性的试验表明,ERICPCR方法具有种系间相关性的鉴别能力。例如,来自三水A场的菌株SC021和SC022同为ERIC E8型;来自三水C场的菌株SC107,SC108,SC109同为ERIC E19型;来自三水E场菌株SC001,SC009,SC016和SC020同为ERIC E28型。来自广东肇庆B场菌株SC058和SC059同为ERIC E10;来自云浮D场SC051和SC053同为ERIC E25型。而大部分来自不同地区的菌株指纹图谱有差异,这和Rafiee M等[4]的报道相一致。

图2 副猪嗜血杆菌15种血清型参考菌株和41株分离株ERIC-PCR聚类分析

ERIC-PCR具有简单、快速、成本低,对操作和试剂以及仪器要求都不高的特点,只需要1台PCR仪就可完成对菌株的基因型的鉴定[7]。对于预测副猪嗜血杆菌菌株的流行趋势,探究其感染源和传播途径等有重要的指导意义。

[1] Kielstein P,Rapp-Gab rielson V.Desig nation of 15 serovars of Haemoph ilus pa rasuis on th e basis of immunodiffusion u sing heatstab le antigen ex tracts[J].Jou rn al of Clinical microbiology,1992,30(4):862-865.

[2] S mart N L,Miniats O P,McInnes J I,etal.Analy sis of Haemo philus parasuis isolates from southern Ontario sw ine by Restriction endonuclease fingerprin ting[J].Can J Vet Res,1988,52:319-324.

[3] del Rio M L,Martin C B,Navas J,et a l.aroA gene PCRRFLP diversity pattern s in Haemo philus parasuis and Actin ob acillus species[J].Research in Veterinary Science,2006,80:55-61.

[4] Rafiee M,Bara M,S tephens C P,eta l.Application of ERICPCR for the comparison of isolates of Haemop hilus parasu is[J].Australian Veterinary Jou rn al,2000,78:846-849.

[5] Macedo N R,Oliveira S R,Lage A P,etal.ERIC-PC R genotyping of Haemop hilus para suis isolates from Brazilian pigs[J].T he Veterinary Jou rnal,2011,188(3):362-364.

[6] 李鹏,李军星,李玉峰,等.中国东南部地区副猪嗜血杆菌分离株ERIC-PCR指纹图谱分析[J].中国兽医学报,2009,29(12):1566-1570.

[7] Nedbalcova K,Satran P,Jang lic Z,eta l.Haemop hilu sp arasu is and Glässer′s disease in pigs:a review[J].Veterinarni Medicina,2006,51(5):168-179.