桂皮酸联合Ndfip1对人肝癌细胞SMMC-7 721细胞增殖与凋亡的协同效应

吕俊明,左安华,王永振,张瀛丹,程 宏

(1.江苏省仪征市人民医院肿瘤科放疗科,江苏扬州,211400;2.扬州大学医学院,江苏扬州,225001)

桂皮酸的抗肿瘤作用首次见于1995年 Liu等[1]的报道,桂皮酸在体外能抑制肺癌、肝癌、前列腺癌、恶性胶质瘤、黑色瘤细胞的增殖和促进其分化。综合近几年的国内外研究表明[2-5],桂皮酸具有广泛的抗实体瘤活性,包括黑色素瘤、激素难治性前列腺癌、肺癌、胶质细胞瘤、肝癌、白血病等,它对肿瘤细胞具有抑制其生长增殖、诱导其分化的作用,而且其衍生物亦具有抗肿瘤活性[6-7]。本课题组前期研究结果表明,Ndfip1在某些肿瘤细胞中随着其表达量的升高,肿瘤细胞凋亡率升高,说明Ndfip1可能对肿瘤细胞的凋亡产生促进作用。根据桂皮酸具有的抗肿瘤作用及Ndfip1可能促进肿瘤细胞凋亡作用的研究结果,本课题通过采用桂皮酸单独作用及与Ndfip1联合作用来研究其对人类肝癌细胞SMMC-7 721细胞增殖及凋亡的影响,为进一步探讨其作用机理做初步尝试,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

293T细胞株由中科院上海细胞所惠赠。SMMC-7 721人肝癌细胞株由扬州大学中西医结合研究所提供。DMEM高糖培养基及胎牛血清等购自Hyclone公司。MTT试剂盒购自Invitrogen公司。桂皮酸购自Alfa Aesar化学产品有限公司。PI-Annexin细胞凋亡试剂盒购自南京凯基公司。可控表达的Ndfip1慢病毒载体由本室构建。转染试剂盒购自QIAGEN公司。4HT(tamoxifen)等试剂购自Sigma公司。Ndfip1抗体由墨尔本大学Jason惠赠。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:293T细胞株及SMMC-7 721人肝癌细胞株培养于含10%的胎牛血清的DMEM高糖培养基中,培养至对数生长期用于实验。

1.2.2 慢病毒的包装与感染:按照QIAGEN公司试剂盒的操作程序,在293T细胞中包装含Ndfip1基因的慢病毒,并转染SMMC-7 721细胞,经嘌呤霉素与潮霉素筛选获得稳定转染的细胞株,经Western blotting鉴定,该细胞株是否为可控表达Ndfip1基因的细胞株。

1.2.3 免疫印迹:收集细胞,经裂解液裂解细胞,收获上清液并经 Lowry′s法测定蛋白浓度。样品经过SDS-PAGE后转移到PVDF膜,用含有5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h,用封闭液稀释的兔抗人Ndfip1抗体室温封闭膜2～3 h,洗涤后将膜于封闭液稀释的HRP-抗兔抗体溶液中室温放置2～3 h,经TBST洗膜后在ECL反应液中反应1 min,暗室显影。

1.2.4 桂皮酸及Ndfip1对细胞生长的干预:桂皮酸使用时用0.1%DMSO(二甲基亚砜)溶解于10%胎牛血清的DMEM 后,用 0.45 μ m的一次性滤器过滤后配成不同浓度培养细胞,同时设Ndfip1表达与不表达的对应组细胞,阴性对照组为0.1%含DMSO、10%FBS的DMEM 培养液,细胞培养于96孔板。培养时间根据需要分别为12 h、24 h及 48 h等。

1.2.5 MTT实验:干预结束后,每孔加入MTT溶液20 μ L,注意避光操作,放入细胞培养箱中继续作用4 h。取出96孔板,将孔内液体吸出后,加入150 μ L DMSO溶解紫色结晶。将96孔板置于细胞培养箱5 min后,置于摇床5 min,转速为80 r/min,酶标仪测定OD490值。

1.2.6 流式细胞术测定细胞凋亡:收集细胞1×106/mL,各自加入凋亡试剂盒中的缓冲液500 μ L重悬细胞,按要求加入PI、Annexin V,每孔各加10 μ L。室温避光放置5～15 min后,立即行流式细胞仪测定实验结果。

2 结 果

2.1 鉴定可控表达Ndfip1基因的SMMC-7721细胞株

经过包装好的病毒感染以及抗生素筛选,获得了多个稳定转染Ndfip1的SMMC-7 721细胞克隆,加入或不加4HT培养24 h后裂解细胞,经过Western blotting分析,发现Ndfip1可以在加入4HT后进行大量表达,而不加4HT则不会表达,实现了可控表达的目的,见图1。

图1 可控表达Ndfip1基因的SMMC-7 721细胞克隆的鉴定

2.2 桂皮酸单独作用或与Ndfip1联合作用对SMMC-7 721细胞增殖抑制率的影响

桂皮酸能有效抑制人肝癌细胞株SMMC-7 721细胞的生长,表现为桂皮酸与细胞间存在时间、剂量依赖性细胞毒效应关系,随着桂皮酸浓度的增加,细胞增殖抑制率相应升高(图2)。各时间组不同浓度两两比较,细胞增殖抑制率差异有统计学意义(P<0.01),各浓度组不同时间两两比较细胞增殖抑制率差异有显著性,其中12 h组与24 h组比较0.5、1、4、8 mmol/L浓度时差异有统计学意义(P<0.01),24h组与48h组比较0.5 、1、4、8 mmol/L 浓度时,差异有统计学意义(P<0.01)。

图2 不同浓度桂皮酸作用12、24、48 h对SMMC-7 721细胞增殖抑制率的影响

在使用4HT诱导Ndfip1表达后,桂皮酸与Ndfip1联合作用能有效抑制细胞的生长,细胞增殖抑制率的改变与桂皮酸单独作用相似,随着桂皮酸浓度的增加,细胞增殖抑制率相应升高,见图3。各时间组不同桂皮酸浓度两两比较细胞增殖抑制率,差异有统计学意义(P<0.01);各浓度组不同时间两两比较细胞增殖抑制率,差异有统计学意义(P<0.01),其中12 h组与24 h组比较0.5、2 、8、15 mmol/L 浓度时 ,差异有统计学意义(P<0.01),1、4 mmol/L浓度时,差异有统计学意义(P<0.05);24 h组与 48 h组比较 0.5、2、4、15 mmol/L浓度时,差异有统计学意义(P<0.01),1、8 mmol/L浓度时,差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 桂皮酸与Ndfip1联合作用对SMMC-7 721细胞增殖抑制率的影响

桂皮酸与Ndfip1联合作用对SMMC-7 721细胞增殖的抑制率明显高于桂皮酸单独作用,作用12、24及48 h后的相关结果都具有显著性差异(P<0.01)。

2.3 桂皮酸单独作用或与Ndfip1联合作用对SMMC-7 721细胞凋亡的影响

桂皮酸能诱导人肝癌细胞株SMMC-7 721发生凋亡,且随着浓度增加,细胞凋亡率也增加。与无药组比较,差异有统计学意义(P<0.01);同时各浓度组间两两比较,差异有统计学意义(P<0.01)。桂皮酸与Ndfip1联合作用可使人肝癌细胞株7 721凋亡率明显增加,与单独使用桂皮酸相比,差异有统计学意义(P<0.01)。见图4。

图4 桂皮酸单独及与Ndfip1联合作用对人肝癌细胞株SMMC-7 721凋亡的影响

3 讨 论

桂皮酸是从肉桂树皮等植物中分离的单体化合物,是苯丙氨酸在植物组织内的脱氨基产物,是调节植物细胞生长和分化的激素样物质。国内外研究表明,它具有广泛的抗实体瘤活性。本实验研究表明,不同浓度的桂皮酸作用于人肝癌细胞株SMMC-7 721时,能明显抑制其增殖,且具有浓度与时间依赖性,有明显统计学差异;通过流式细胞术检测细胞凋亡表明,桂皮酸单独作用于上述细胞时,能明显促进其凋亡,其凋亡率具有时间与浓度依赖性,有明显统计学差异。

Ndfip1蛋白是一种于 2000年通过 Farwestern被发现的跨膜蛋白,因其与Nedd4(neural precursor cell expressed,developmentally down-regulated)蛋白特异结合而命名[8]。Nedd4蛋白与泛素化过程密切相关,是一种具有Hect(homologous to E6-AP Carboxyl terminus)结构域的E3泛素连接酶,可通过催化泛素与相关的靶蛋白结合而启动该蛋白的降解程序[9-10]。实验检测发现Ndfip1蛋白在外伤区域周围的残存神经细胞上有明显高表达,同时伴随其结合蛋白Nedd4表达数量增加,推测这两种蛋白的高表达及结合后可能有助于在损伤神经细胞中清除有害的错误折叠蛋白,促进神经细胞的存活[11]。

本研究表明,桂皮酸与Ndfip1联合作用于SMMC-7 721细胞时,其抑制增殖、促进凋亡的作用均较桂皮酸单独作用升高,表明Ndfip1蛋白兼具对神经细胞的保护作用及对其他肿瘤细胞的促凋亡作用,同时也表明桂皮酸与Ndfip1蛋白具有协同作用。

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