p300/CBP、Smad4在非小细胞肺癌组织中的表达

王恩旺，杨小龙，邓小乐

(1.马鞍山市人民医院 心胸外科，安徽 马鞍山 243000;2.皖南医学院附属弋矶山医院 心胸外科，安徽 芜湖 241001)

p300/CBP为组蛋白乙酰转移酶，是同源转录辅助激活因子，具有内在乙酰转移酶活性。Smad4为抑癌基因，是目前发现的惟一一种CO-Smads，其蛋白产物是TGF-β超家族受体的直接底物。p300/CBP可通过与Smads结合增强TGF-β诱导的转录活性。本实验采用免疫组织化学的方法(SABC法)，测定肺癌和正常肺组织中p300/CBP、Smad4蛋白的表达，观察其结果与肺癌临床病理的关系，并分析它们之间的相关性，旨在探讨 p300/CBP、Smad4在NSCLC发病机制中的作用，同时为p300/CBP、Smad4用于NSCLC的抗肿瘤治疗提供一定的实验和理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选用2008年1月～2009年1月皖南医学院附属弋矶山医院术前未经放疗和化疗的原发性肺癌手术标本(石蜡包埋)60例。取上述标本中距离肿瘤边缘6 cm以上的正常肺组织20例、并经病理检查排除肿瘤累及。标本经10%甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，4 μm厚度连续切片，进行免疫组织化学染色，其中一片行HE常规染色用于病理诊断。组织病理分型、分级由病理科诊断。60例NSCLC中男性43例，女性17例。≥55岁33例，＜55岁27例。病理分型:肺鳞癌38例，肺腺癌22例。中心型肺癌28例，周围型肺癌32例。无淋巴结转移17例，有淋巴结转移43例。按1997年国际抗癌联盟(UICC)新修订的肺癌TNM分期:ⅠA期3例、ⅠB期14例、ⅡA期12例、ⅡB期17例、ⅢA期14例，无ⅢB、Ⅳ期病例。肿瘤直径＞3 cm 29例，≤3 cm 31例。分化程度:高分化+中分化为39例，低分化21例。

1.2 主要试剂 Smad4浓缩型兔多克隆抗体(武汉博士德)，p300/CBP浓缩型鼠抗人单克隆抗体(NeoMarker)，SABC免疫组化试剂盒和3-3'二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(武汉博士德)。

1.3 方法 免疫组织化学SABC法60例肺鳞癌和肺腺癌均行 Smad4(1∶50)、p300/CBP(1∶100)免疫组织化学染色。染色方法按说明书进行。以磷酸缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照，Smad4、p300/CBP阳性切片作为阳性对照。

1.4 结果判定

1.4.1 Smad4蛋白定位于肺泡上皮细胞浆(胞核)或癌细胞浆(胞核)内，细胞内呈现棕黄色细小颗粒者为阳性染色。根据染色阳性的细胞数占总细胞数的百分比分为:阳性细胞＜20%为阴性，阳性细胞≥20%为阳性表达。

1.4.2 p300/CBP蛋白定位于癌细胞核内和支气管黏膜上皮细胞核内，部分呈核-浆型，细胞核被染成棕黄色为p300/CBP阳性表达。每张切片在400倍镜下观察5个视野，每个视野计数100个肿瘤细胞，共计500个细胞，无p300/CBP阳性表达者计0分，阳性细胞数≤10%为1分，11% ～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。再按染色强度评分:无色为0，淡色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。最后将阳性细胞所占计数细胞百分比的染色分级与强度分级两项指标评分相乘，得出染色等级评分:“-”(0～2)，“+”(3～4)，“⧺”(6～8)，“⧻”(9～12)。“-”为阴性表达，“+”、“⧺”及“⧻”为阳性表达，其中“⧺”和“⧻”为过度表达［1］。

1.4.3 正常肺组织分级参照上述标准。

1.5 统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。采用χ2检验分析各组计数资料;NSCLC中p300/CBP表达与肿瘤各临床病理特征之间的分析，不同分组之间采用秩和检验(Mann-Whitney U，或 Kruskal-Wallis Test);正常肺组织中及NSCLC中p300/CBP、Smad4的表达、相互之间的关系及双向有序资料采用Spearman等级相关分析。P＜0.05视为差异有统计学意义。

2 结果

p300/CBP在正常肺组织中呈中-低表达，阳性表达率为35.0%(7/20)，未发现有过表达(0/20)，在NSCLC组织中阳性表达率为65.0%(39/60)，过表达率为51.7%(39/60)，主要表达于细胞核(见图1～6)。

Smad4在正常肺组织中呈高表达，阳性表达率为90.0%(18/20)，在NSCLC组织中逐渐降低呈中-高度表达，阳性表达率为63.3%(38/60)，主要表达于细胞质或细胞核中(见图1～6)。

p300/CBP和Smad4均与NSCLC淋巴结转移、分期等临床病理学参数有关(P＜0.05)，在无淋巴结转移组明显高于有淋巴结转移组，均随着肿瘤分期的增高而降低(见表1、2)。

p300/CBP的表达还与NSCLC分化有关，在中、高分化肺癌细胞的表达明显高于在低分化肺癌细胞中的表达(P ＜0.05)，呈轻度负相关 (rs=-0.287，P=0.026)，见表1。

p300/CBP、Smad4在NSCLC组织中阳性表达率呈中度负相关(rs=-0.413，P=0.001)，见表3。

表1 p300/CBP在NSCLC临床病理特征不同组之间的表达Tab 1 p300/CBP expression by classification of clinicopathologic features in NSCLC

表2 Smad4在NSCLC临床病理特征不同组之间的相关性Tab 2 Correlation of Smad4 expression by classification of the clinicopathologic features in NSCLC

表3 p300/CBP、Smad4在NSCLC表达关系Tab 3 Relationship between expression of Smad4 and p300/CBP in NSCLC

4 讨论

p300/CBP是同源转录辅助激活因子，分别位于22p13和16p13.3，具有内在的乙酰转移酶活性，催化可逆的组蛋白乙酰化。p300/CBP本身亦可减缓由染色质本身结构介导的启动子抑制作用和恢复靶基因启动子基础转录器效应［2］。

p300/CBP作为原癌蛋白，可抑制肿瘤，但可有异常活化，为诱导肿瘤的癌蛋白。p300/CBP是细胞周期负调节基因。p300/CBP通过活化AP-1，调控cyclin D1基因表达。E2F家族过度表达与肺癌密切相关，并且随肿瘤分期升高而增高。E2F可在p300/CBP赖氨酸残基上被乙酰化，在分子水平上CDK介导p300/CBP和E2F-1相互作用、促进细胞进入不可逆的过程［3］。p21WAF/CIP1可上调p300/CBP活性表达，从而抑制细胞周期运行。DNA的复制和修复同样需要p300/CBP的参与。p53突变是不同类型肺癌中最常见的基因改变，且出现的频率比其他肿瘤高。突变型p53不仅失去了正常的抑癌作用，而且还促进恶性转化。p300/CBP的CH1区域对p53有泛素连接酶活性，p300/CBP通过Mdm2依赖或非依赖机制调节p53泛蛋白化作用和降解，有助于控制 p53 稳定性［4］。p53 可被包含 p53、Mdm2 和p300/CBP的三元络合物降解。在p53信号通路中，p300/CBP还通过乙酰化使Mdm2失活，引发细胞凋亡［5］。本研究的实验结果显示，p300/CBP在NSCLC的性别、年龄、肿瘤部位、病理类型各不同组之间的表达，P＞0.05，差异无统计学意义。p300/CBP在无淋巴结转移的肺癌组织中阳性表达明显高于有淋巴结转移的肺癌组织(P＜0.05)，呈轻度负相关 (rs=-0.372，P=0.003)。p300/CBP 的表达随着肿瘤级别的增高而降低，在中、高分化肺癌细胞中的阳性表达明显高于在低分化肺癌细胞中的表达(P＜0.05)，呈轻度负相关 (rs=-0.287，P=0.026)。p300/CBP的表达亦随着肿瘤分期的增高而降低，三组之间的表达有明显差异 (P＜0.05)，并呈中度负相关 (rs=-0.573，P=0.001)。CBP 在早期上皮细胞癌中过度表达已被证实，CBP的过度表达、或优先使用是通过特定活跃的转录因子，或两者联合体，并且在肺癌中不抑制细胞增殖和死亡［6］。Smad4系位于l8q21.1上的抑癌基因，其蛋白产物是TGF-β超家族受体的直接底物。TGF-β家族是为数不多的内源性细胞生长调节蛋白，主要调控细胞增殖、分化、迁移、免疫反应、血管生成、凋亡及细胞外基质的沉积。TGF-β信号通路失调能够促进肿瘤发生、浸润和转移的进程，恢复TGF-β信号通路则可减少人类肿瘤(如肺癌)的发生［7］。TGF-β需Smads将刺激所产生的信息从细胞内传递至细胞核。Smad4蛋白是目前发现的惟一一种CO-Smads，因为其可以和其他Smad蛋白形成复合体，有效地传递任务而居关键性地位，目前对其调控TGF-β诱导的基因表达研究较多:Ke Z等［8］应用免疫组化等方法分析肺癌组织中各种不同血管生成因子表达以及瘤内微血管密度，结果显示Smad4表达缺失和瘤内微血管密度具有显著的相关性，提示Smad4作为调节因子在肺癌的血管发生中起着重要的作用。Smad4基因发生突变，将伴随着癌症的发生。若调节Smad4蛋白在细胞中的功能，可以进一步抑制癌症的生成［9，10］。本研究的实验结果显示，正常肺组织Smad4阳性表达率为90.0%，肺癌组织中Smad4蛋白的表达率为63.3%，低于正常组织(P＜0.05)。Smad4在NSCLC的性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小和病理类型和分化程度各不同组之间的表达，P＞0.05，差异无统计学意义。Smad4在无淋巴结转移的肺癌组织中阳性表达明显高于有淋巴结转移的肺癌组织(P＜0.05)，呈轻度正相关(rs=0.295，P=0.022)。Smad4阳性表达率随着肿瘤分期的增高而降低 (P＜0.05)，呈中度正相关(rs=0.487，P=0.000)。提示Smad4表达与肺癌发生发展、生物学行为及其预后有密切关系，其作用机制与Smad4本身的生物学作用有关。

p300/CBP可通过与Smads结合增强TGF-β诱导的转录活性。p300/CBP在Smad4的存在下，增强TGF-β及 Smads诱导的转录活性。p300/CBP、Smad4的有机结合，以及协同激活子的参与，能使TGF-β 诱导的基因表达增强［11］。p300/CBP、Smads蛋白的低表达可使TGF-β的信号转导途径的中断，从而使上皮细胞逃脱了TGF-β对其生长抑制作用。Smads、p300/CBP可作为整体与不同的转录因子结合，但其他转录因子也可和Smads竞争性地与p300/CBP结合、或直接干扰Smads而妨碍Smads介道的转录。本研究的实验结果显示:正常肺组织中p300/CBP与 Smad4的表达无相关(rs=-0.105，P=0.660)，NSCLC组织中 p300/CBP与Smad4的表达呈中度负相关(rs=-0.413，P=0.001)，且均与NSCLC的淋巴结转移和 TNM分期相关，提示在NSCLC的一系列病程发展过程中，高表达的p300/CBP与Smad4的协同作用可能是NSCLC肿瘤细胞永生化的重要因素。故联合检测p300/CBP和Smad4的表达，在预测NSCLC的恶性生物学行为方面可能比单因素检测更具有意义，预计联合使用分别针对 p300/CBP及 Smad4靶向药物，有望提高NSCLC治疗的有效率。

总之，肺癌的发生是多因素、多步骤的过程，可同时有原癌基因激活和抑癌基因灭活。随着对p300/CBP结构和功能等相关研究的不断深入，将有助于在人类细胞中具有抗癌药物一样功能的p300/CBP抑制剂的问世，为肿瘤的防治工作带来新的契机。

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