蝮蛇毒PCA抗血栓形成的实验研究

李 曙，张根葆，2，李 伟

(皖南医学院 1.病理生理学教研室;2.蛇毒研究所，安徽 芜湖 241002)

蛇毒是多种生物活性蛋白和多肽的混合物，其中许多组分有明显的促凝血或抗凝血、促血栓形成或溶解血栓、促血小板聚集或抗血小板聚集等功能，特别是蝮科和蝰科蛇毒对血液循环功能的影响尤为明显［1］。近年来本室从蝮蛇粗毒中分离纯化出一种分子量约14～17 ku的具有抗凝活性的蛋白质，其可特异性激活血浆中蛋白C(PC)从而发挥抗凝活性。现通过制备的家兔体外血栓、大鼠半体内血栓及检测血浆凝血功能有关指标，来研究其抗栓效应并报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与主要仪器 PCA通过离子交换层析法从皖南山区的蝮蛇粗毒中提取;月桂酸钠(上海润捷化学试剂有限公司);TEG®5000型血栓弹力仪系统(美国 Haemoscope Corporation);LBY-F/S5血栓形成仪(北京普利生仪器中心);MC-2000双通道血凝仪(德国美创);阿司匹林肠溶片(进口分装，批号BJ02993)。

1.1.2 实验动物 健康家兔40只(体重2.5 kg左右);SD雄性大鼠60只(体重220 g左右)，由本院实验动物中心提供。

1.2 动物模型的复制和血栓的制备

1.2.1 大鼠冠状动脉微血栓模型的复制 SD雄性大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠(0.1 ml/100 g)后，固定，分离颈部，气管插管，呼吸机辅助通气(呼吸频率54次/min，潮气量2 ml/100 g)，沿胸骨左缘剪开第二肋骨，暴露心脏，分离主动脉并用血管夹夹闭主动脉根部，迅速以微量注射器从心尖部直接向左心室注入月桂酸钠1.0 mg/kg(浓度10 mg/ml);夹闭20 s后，松开血管夹，心跳稳定后逐层关胸［2］。

1.2.2 动物分组与给药 健康雄性 SD大鼠60只，随机分为假手术(SH)组、心肌梗死模型(MI)组、PCA 干预组(MI+PCA 组分为0.5 mg/kg、2 mg/kg、8 mg/kg 3个剂量组)、阳性对照组(阿司匹林5 mg/kg)［3］，每组10只。微血栓模型复制10 min后，MI+PCA组舌静脉注入不同剂量同体积的PCA组分;而MI组只注入同体积生理盐水，阳性对照组注入同体积的5 mg/kg的阿司匹林;SH组不复制微血栓模型，仅以微量注射器从心尖部直接向左心室注入生理盐水，10 min后舌静脉分别注入同体积的生理盐水。

1.2.3 血栓制备 用 Chandler法［4］制备的家兔体外血栓模型的抗栓实验:取家兔40只，随机分为4组，每组10只，各兔静脉注射3%戊巴比妥钠麻醉。分离家兔颈总动脉，在1 min内取1 ml注入血栓形成仪(硅化)聚乙烯管中，同时将 50 μl、30 μl、10 μl(0.6216 mg/ml)蝮蛇毒PCA组分大、中、小3个剂量注入各给药组管中;对照组注入相同体积生理盐水，37℃条件下以16 r/min在恒流泵上旋转制备血栓。然后倾出血栓，用滤纸吸干水份，称取血栓湿重，后放入烘箱，60℃烘烤15 min，称血栓干重。

用Chandler法制备大鼠半体内血栓模型的抗栓实验:各实验组动物均于术后3 h颈总动脉取血，按上述方法制备血栓，观察其大鼠半体内血栓模型的抗栓效应。

1.2.4 凝血功能 取血、抗凝、离心(1 000 r/min，10 min)。按照仪器规程分别测定血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)、凝血酶时间(TT)，在采血后2 h内测定完毕。

2 结果

2.1 蝮蛇毒PCA组分对体外血栓的影响，见表1和图1。

表1 蝮蛇毒PCA组分对家兔体外血栓的影响(±s，n=10)Tab 1 Effects of PCA on thrombus in the plasma of rabbits in vitro(±s，n=10)

表1 蝮蛇毒PCA组分对家兔体外血栓的影响(±s，n=10)Tab 1 Effects of PCA on thrombus in the plasma of rabbits in vitro(±s，n=10)

注:秩和检验，大中小剂量组分别与对照组比较，字母不同表示P ＜0.05，字母相同表示 P ＞0.05

组别 剂量(0.6106 mg/ml)血栓湿重(mg)血栓干重(mg)长度(cm)对照组 0 138.7 ±11.6a72.4 ±9.9a 2.2 ±0.3a小剂量组 10 91.9 ±7.3b50.5 ±18.3b1.9 ±0.3b中剂量组 30 75.0 ±5.9c 38.3 ±2.4c 1.5 ±0.1c大剂量组 50 0d 0d 0d

从表1可见蝮蛇毒PCA组分大、中、小三剂量组与对照组相比较，血栓的干、湿重量及长度均比对照组减轻(P＜0.05)。表明蝮蛇毒PCA组分对家兔体外血栓模型有明显的抗栓效应。

2.2 蝮蛇毒PCA组分对大鼠半体外血栓的影响，见表2和图2。

表2 蝮蛇毒PCA组分对大鼠半体外血栓的影响(±s，n=10)Tab 2 Effects of PCA on thrombus in the plasma of rats in vitro(±s，n=10)

表2 蝮蛇毒PCA组分对大鼠半体外血栓的影响(±s，n=10)Tab 2 Effects of PCA on thrombus in the plasma of rats in vitro(±s，n=10)

注:两两之间比较，经q检验，字母不同表示P＜0.05，字母相同表示 P ＞0.05

组别 血栓湿重(cm) 血栓干重(cm) 长度(cm)SH 组 101.6 ±34.1a 53.2 ±18.3a 2.1 ±0.5a 0.000 0.000 0.000 MI组 244.9 ±25.9b 126.1 ±17.4b 10.0 ±0.9b阳性对照 138.1 ±22.1c 63.2 ±10.1c 2.3 ±0.3a MI+PCA组0.5 mg/kg 255.8 ±33.5b 129.9 ±19.9b 9.9 ±1.4b 2 mg/kg 173.4 ±23.7c 78.5 ±12.2c 3.4 ±0.5c 8 mg/kg 151.5 ±21.6c 67.3 ±12.2c 2.9 ±0.4a F 值 50.118 46.348 244.159 P值

从表2可见，MI+PCA组(2 mg/kg、8 mg/kg)与MI组比较，血栓的干、湿重量长度均有明显差异(P ＜0.05)，与阳性对照组无差异(P ＞0.05)。可说明PCA组分对大鼠半体内血栓模型有明显的抗栓效应。

图1 蝮蛇毒PCA组分对家兔体外血栓的影响(±s，n=10)Fig1 Effects of PCA on thrombus in the plasma of rabbits in vitro(±s，n=10)

图2 蝮蛇毒PCA组分对大鼠半体外血栓的影响(±s，n=10)Fig2 Influence of PCA on thrombus in the plasma of rats in vitro(±s，n=10)

2.3 蝮蛇毒PCA组分对大鼠凝血功能的影响，见表3。从表3可见，MI+PCA组(2 mg/kg、8 mg/kg)与MI组比较，PT、APTT均明显增高(P＜0.05)，FIB显著降低(P＜0.05)，TT差异无统计学意义(P＞0.05);MI组与 SH 组比较，PT、APTT均明显降低(P ＜0.05)，FIB 显著增高(P ＜0.05)。

表3 蝮蛇毒PCA组分对大鼠凝血功能的影响(±s)Tab 3 Effects of PCA on the blood coagulation of rats(±s)

表3 蝮蛇毒PCA组分对大鼠凝血功能的影响(±s)Tab 3 Effects of PCA on the blood coagulation of rats(±s)

注:与 SH组比较，*P ＜0.05;与 MI组比较，#P ＜0.05

组别 n PT(s) APTT(s) TT(s) FIB(g/L)SH 组 10 16.21 ±0.63# 33.25 ±2.10# 15.72 ±1.13 1.92 ±0.18#0.000 0.000 0.576 0.000 MI组 10 10.72 ±0.52* 14.67 ±1.54* 16.19 ±2.02 5.50 ±0.25*阳性对照 10 15.63 ±0.54# 31.56 ±3.57# 15.84 ±1.17 2.30 ±0.21*#MI+PCA 组(0.5 mg/kg) 10 10.61 ±0.66* 16.33 ±2.19* 15.42 ±1.71 5.59 ±0.35*MI+PCA 组(2 mg/kg) 10 14.68 ±0.65*# 28.28 ±2.12*# 16.57 ±1.19 2.45 ±0.19*#MI+PCA 组(8 mg/kg) 10 15.93 ±0.84# 31.96 ±2.47# 15.84 ±1.17 2.30 ±0.27*#F 值 161.559 118.933 0.770 476.105 P值

3 讨论

本室多年来一直从事皖南地区蝮蛇毒提取物的应用研究，并做了大量的前期工作和动物实验，积累了一定经验，对于皖南蝮蛇毒PCA的分离纯化技术较为成熟，并多次分离纯化出蝮蛇毒PCA组分。本研究以现有方法技术及条件可比较稳定地从皖南地区AHV粗毒中分离纯化出PCA抗凝组分［5］。PC系统是存在于人血浆中的天然抗凝系统，是体液抗凝的主要成分之一。

近年来，随着社会人口的老龄化和生活水平的不断提高，各种血栓性疾病的发病率逐年升高，病死率已跃居首位。而血小板功能的亢进是血栓性疾病的直接危险因素。迄今达成共识的是:所有血栓，无论发生在动脉或静脉，都是由血小板粘附于血管壁内膜开始的。血小板参与血栓形成过程的许多环节，在血栓形成过程中起核心作用［6～8］。实验中月桂酸钠制造的外周动脉血栓模型依靠月桂酸钠强烈的内皮损伤作用，可造成内皮的脱落，甚至穿孔;触发炎症性介质如白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、炎症反应性蛋白、粘附分子等的释放后触发血小板活化，机体的这种改变使血液处于高凝状态。早在1865年，德国病理学家Virchow就已提出血栓形成的三要素，即:①血管壁的改变，②血流的改变(血流的缓慢、停止或者形成涡流)，③血液成份性质的改变。后者常与血液中血小板、凝血因子、纤溶系统的功能有关。

凝血四项分别反映的是外源凝血系统、内源凝血系统、抗凝系统及纤溶系统的功能。实验心梗模型大鼠凝血因子均有明显增加，纤溶系统也相应改变，纤溶活性降低。在蝮蛇毒PCA组分干预后，有效改善了血液的高凝状态。

Chandler体外法制备的血栓在塑料管内形成，血流速度恒定，故上述之因素中血管壁的变化、血流的变化是稳定不变的，唯一变化的是血液的成份性质。体外及半体外的血栓制备结果显示，干预组、给药组形成的血栓的干湿重及长度都比模型组、对照组血栓的干、湿重减轻(P＜0.05)，长度也明显变短(P＜0.05)。凝血功能检测显示MI+PCA组(2 mg/kg、8 mg/kg)与MI组比较，PT、APTT均明显增高(P＜0.05)，FIB 显著降低(P ＜0.05)。这些结果充分论证了我室提取的PCA抗凝组分有效改善了血液流变学特性，抑制血小板等成分形成血栓［9～11］，具体通过何种途径改变血小板活性还有待进一步研究。

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