LC-MS/MS法测定人血浆中替米沙坦的浓度及其人体生物等效性研究

王国才，张丹，杨漫，郑天雷，王涛，王振龙，韩静，刘会臣（航天中心医院临床药理室，北京市100049）

替米沙坦是一种特异性血管紧张素Ⅱ受体（AT1型）拮抗药，可替代血管紧张素Ⅱ与AT1受体亚型（已知的血管紧张素Ⅱ作用位点）高亲和性地结合，结合作用持久，且在AT1受体位点无任何激动药效应，对其他受体（包括AT2和其他特征更少的AT受体）无亲和力。其降压效果好、副作用小，每日口服1次即可产生24 h持续降压效果，是一种长效、高效、低毒的新型降压药。目前国内外对生物样本中替米沙坦的测定方法主要有高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱电喷雾法（LC-MS/MS）等，但这些方法都存在一定的局限性，如样本处理过程复杂[1]、线性范围较窄[2]、血浆用量较大[3～6]、检测时间较长等。为了研究替米沙坦口服制剂的人体药动学，评价其人体生物等效性，本试验拟建立高效、灵敏、准确、专属性强的LC-MS/MS法，以测定人血浆中替米沙坦浓度。

1 材料

1.1 仪器

API3200型三重四极杆串联质谱仪，配有电喷雾离子化源（ESI）以及Analyst 1.4.2数据处理软件（美国Applied Biosystems公司）；Prom inence 20A液相色谱仪，包括LC-20AD型二元泵、DGU-20A3型脱气机、SIL-20A型自动进样器、CTO-20A型柱温箱、CBM-20A系统控制器（日本Shimadzu公司）；QB-600型高速振荡混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；3-18K台式高速离心机（德国Sartorius Stedim Biotech公司）。

1.2 试药

受试制剂：替米沙坦片（北京万生药业有限责任公司研制并提供，规格：每片80mg，含量：99.8%）；参比制剂：替米沙坦片（商品名：美卡素，上海勃林格殷格翰药业有限公司生产，北京万生药业有限责任公司提供；规格：每片80mg，含量：99.8%）；替米沙坦对照品（纯度：99.3%，批号：100629-200401）、克拉霉素对照品（纯度：99.0%，批号：130558-200501）均由中国食品药品检定研究院提供。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。空白人血浆由航天中心医院提供或来自于健康受试者。

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱条件

预柱：Phenomenex C18保护柱（4.0mm×3.0mm，5μm）；色谱柱：Zorbax SB-C18Narrow Bore柱（150mm×2.1mm，5μm）；流动相：甲醇-10mmol·L－1乙酸铵（含0.5%甲酸）（80∶20）；流速：0.4m L·min－1；柱温：40 ℃；进样量：5 μL。

离子源：电喷雾离子化源；离子喷射电压：1 800 V；温度：550 ℃；源内气体 1（GS1，N2）压力：40 psi；气体2（GS2，N2）压力：65 psi；气帘气体（N2）压力：20 psi；正离子方式监测；扫描方式：多重反应监测（MRM）；用于定量分析的离子反应分别为m/z515.2→276.2（替米沙坦）和m/z 748.5→158.2（克拉霉素）；解簇电压（DP）分别为93 V和45 V；碰撞能量（CE）分别为56 eV和35 eV；碰撞气（CAD，N2）压力：3 psi；Q1和Q3分辨率均为UNIT。

2.2 试验溶液的制备

2.2.1 对照品贮备液：准确称取替米沙坦对照品5.04mg（相当于替米沙坦5.00mg），置于10m L容量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度，配制成相当于替米沙坦500µg·m L－1的母液。精确取替米沙坦母液1m L于5m L容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成浓度为100µg·m L－1的替米沙坦贮备液。

2.2.2 质控（QC）溶液：取适量替米沙坦贮备液，用乙腈稀释成浓度分别为15.0、300、6 000 ng·m L－1的QC溶液。

2.2.3 标准曲线样本：分别取适量替米沙坦贮备液，用空白血浆稀释成浓度分别为1.00、3.00、12.0、60.0、200、1 200和1 500 ng·m L－1的标准曲线样本。

2.2.4 QC样本：分别取适量替米沙坦贮备液，用空白血浆稀释成浓度分别为3.00、60.0、1 200 ng·m L－1的QC样本。

2.2.5 内标溶液：准确称取5.05mg克拉霉素对照品（相当于克拉霉素5.00mg）于5m L容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成浓度为1.00mg·m L－1的克拉霉素母液。精确取40µL克拉霉素母液于10m L容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成克拉霉素浓度为4.00µg·m L－1的内标溶液，于4℃冰箱中保存。

2.3 血浆样本处理

取血浆50μL，分别加入内标溶液10μL、乙腈390μL，涡旋1m in，10 000 r·m in－1离心10m in，取全部上清液转移至另一个干净1.5m L塑料离心管，加入150μL纯水，涡旋1m in，取200μL于进样瓶中进行LC-MS/MS分析。

2.4 方法验证

2.4.1 质谱分析：用蠕动泵分别将替米沙坦的乙腈溶液（1.00µg·m L－1）和克拉霉素的乙腈溶液（1.00 µg·m L－1）以5 µL·m in－1的恒定流速泵入MS/MS系统，相应的二级全扫描质谱图见图1。

2.4.2 专属性：分别取6个不同来源的空白血浆各50μL，以等体积的乙腈代替内标溶液，按“2.3”项下方法操作，得色谱图（其中1名受试者空白血浆样本提取后色谱图见2A）；取替米沙坦浓度为1.00 ng·m L－1标准曲线样本50 µL，按“2.3”项下方法操作，得色谱图2B；取1名受试者给药后收集的血浆样本，按“2.3”项下方法操作，得色谱图2C。结果表明，替米沙坦和内标克拉霉素的保留时间分别约为1.51m in和1.25m in，空白血浆中的内源性物质不干扰替米沙坦和克拉霉素的测定。

2.4.3 基质效应：取空白血浆（6个不同来源）50μL，以等体积的乙腈代替内标溶液，按“2.3”项下方法操作，取离心后全部上清液至另一干净1.5m L塑料离心管中，分别加入低、中、高3个

浓度（分别为15.0、300、6 000 ng·m L－1）的QC溶液10 μL、内标溶液10μL、纯水150μL，涡旋后取200μL于进样瓶中进行LC-MS/MS分析，每浓度6样本，获得替米沙坦和克拉霉素的峰面积。同时以40μL纯水代替50μL空白血浆（按“2.3”项下方法操作时50μL血浆产生沉淀的体积约10μL），加入乙腈400 μL后，分别加入低、中、高3个浓度（分别为15.0、300、6 000 ng·m L－1）的QC溶液10 μL、内标溶液10μL、纯水150 μL，涡旋后取200μL于进样瓶中进行LC-MS/MS分析，每浓度6个样本，获得替米沙坦和克拉霉素的峰面积。以每一浓度前种处理方法所得替米沙坦的峰面积（各6个样本）除以后种处理方法所得替米沙坦的平均峰面积（每浓度6个测定值的平均值），计算其基质效应。结果，低、中、高3个浓度血浆样本中替米沙坦的基质效应分别为（124.4±4.9）%，（122.5±4.3）%和（118.5±1.3）%，平均基质效应为（121.8±4.4）%。以前种处理方法所得克拉霉素峰面积（共18个样本）除以后种处理方法所得克拉霉素的平均峰面积（18个测定值的平均值），计算其基质效应。结果，血浆样本中克拉霉素的基质效应为（107.3±3.0）%。

2.4.4 标准曲线和定量下限：取“2.2.3”项下标准曲线样本50 μL，按“2.3”项下方法操作，记录色谱。以血浆中待测物浓度为横坐标（X），待测物与内标的峰面积比值（Y）为纵坐标，用加权（W＝1/X2）最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为工作曲线。每个分析批建立1条工作曲线，每浓度2个样本，连续测定3个分析批。典型曲线回归方程为：Y＝0.003 13 X+0.000 382（r＝0.998 5）。结果说明，替米沙坦血药浓度在1.00～1500 ng·m L－1范围内线性关系良好。另按“2.3”项下方法操作，处理替米沙坦浓度为1.00 ng·m L－1的样本，每个分析批6样本，连续测定3个分析批，以相应分析批的工作曲线计算样本的浓度，根据测定结果计算样本的相对误差（RE），及日内、日间RSD。结果，RE在±15%以内，日内、日间RSD均＜20%，因此定量下限为1.00 ng·m L－1。

2.4.5 准确度与精密度：按“2.3”项下方法操作，处理替米沙坦低、中、高3个浓度（分别为3.00、60.0、1 200 ng·m L－1）的QC样本，每浓度6样本，连续测定3个分析批，以同一分析批的工作曲线计算QC样本的浓度，根据QC样本的测定结果计算方法的准确度与精密度。结果，RE均在±15%以内，日内、日间RSD均＜15%。准确度及精密度试验结果见表1。

2.4.6 提取回收率：按“2.3”项下方法操作，处理替米沙坦低、中、高3个浓度（分别为3.00、60.0、1 200 ng·m L－1）的QC样本，取离心后全部上清液体至另一干净1.5m L塑料离心管中，加入乙腈20μL、纯水150μL，涡旋后取200μL于进样瓶中进行LC-MS/MS分析，每浓度6样本，获得替米沙坦和克拉霉素的峰面积。同时另取空白血浆50μL，以等体积的乙腈代替内标溶液，按“2.3”项下方法操作，取离心后全部上清液至另一干净1.5m L塑料离心管中，分别加入低、中、高3个浓度（分别为15.0、300、6 000 ng·m L－1）的QC溶液10 μL、内标溶液10 μL、纯水150μL，涡旋后取200μL于进样瓶中进行LC-MS/MS分析，每浓度6样本，获得替米沙坦和克拉霉素的峰面积。以每一浓度前种处理方法所得替米沙坦的峰面积（各6个样本）除以后种处理方法所得替米沙坦的平均峰面积（每浓度6个测定值的平均值），计算其提取回收率。结果低、中、高3个浓度血浆样品中替米沙坦的提取回收率分别为（92.5±5.3）%、（95.4±2.3）%和（91.1±2.4）%，平均提取回收率为（93.0±3.9）%。以前种处理方法所得克拉霉素峰面积（共18个样本）除以后种处理方法所得克拉霉素的平均峰面积（18个测定值的平均值），计算其提取回收率。结果血浆样品中克拉霉素的提取回收率为（96.2±3.2）%。

表1 准确度及精密度试验结果（n＝18）Tab 1 Resultsof precision and accuracy tests（n＝18）

2.4.7 稳定性试验：取QC样本50μL，分别考察血浆样本室温放置8 h、反复冻融3次、－80℃冰冻放置1个月以及血浆样本经处理后于自动进样器中室温放置24 h后替米沙坦的稳定性，每浓度3样本。结果，测定浓度与理论浓度的RE均在±11%以内，表明在血浆样本室温放置、反复冻融3次、长期－80℃冰冻放置以及处理后分析测定过程中，替米沙坦均较为稳定，各贮存条件不影响对样本浓度进行准确测定。稳定性试验结果见表2。

表2 稳定性试验结果（n＝3）Tab 2 Resultsof stability tests（n＝3）

2.5 方法应用

2.5.1 受试者的选择：22名男性受试者，年龄（25±3）岁，体重（63.1±7.0）kg。试验前体格检查、实验室检查（血常规、尿常规、肝功能、肾功能、血糖、乙型肝炎表面抗原、梅毒、艾滋病抗体）、心电图检查、胸片检查均合格。受试者无过敏体质、药物过敏史、晕针史，试验前2周内未用任何的药物。试验前均签署知情同意书。

2.5.2 给药方案及血样采集：根据国内、外已上市替米沙坦片的说明书，本试验采用临床常用剂量（80mg）。采用随机双周期自身交叉对照试验设计，口服替米沙坦片受试制剂和参比制剂。每名受试者分2周期口服受试制剂和参比制剂各1次，间隔时间为2周。受试者于试验前1天下午入住药物临床试验病房，吃清淡晚餐（18∶00～19∶00）后禁食不禁水；第2天早上8∶00点左右，由医护人员发放受试制剂或参比制剂，受试者空腹服药，用200m L温开水送服。用药后保持上身直立状态2 h，其后可自由饮水，4 h统一进食标准餐。试验过程中，禁用其他药物或含咖啡因类成分的饮料，禁止吸烟、饮酒，按时休息，避免剧烈活动。受试者于用药前0 h及用药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、48、72、96 h时于肘静脉取血约2m L，3 000 r·min－1离心10min，取血浆，立即置－80 ℃冰箱中保存，备测。

2.5.3 生物等效性评价：22名志愿者口服替米沙坦片受试制剂和参比制剂后，平均药-时曲线见图3。主要药代动力学参数分别为cmax（358±212）ng·m L－1和（389±298）ng·m L－1，tmax（1.50±0.78）h和（1.59±1.16）h，t1/2（25.5±12.5）h和（26.5±11.8）h，AUC0～96h（2 383±11 46）ng·h·m L－1和（2 411±1 192）ng·h·m L－1，AUC0～∞（2 513±1 194）ng·h·m L－1和（2 555±1 255）ng·h·m L－1。替米沙坦片受试制剂的平均相对生物利用度为（101.6±22.8）%（以 AUC0～t计）、（101.3±22.6）%（以AUC0～∞计）。主要药动学参数cmax、AUC0～t、AUC0～∞对数转换后进行方差分析、双向单侧t检验和90%置信区间计算，tmax采用配对Wilcoxon法检验，结果表明2种制剂具有生物等效性。

2.6 不良反应

本试验共发生6人8例/次不良事件，其中2人3例/次与试验用药可能有关，判断为不良反应。所有不良事件均为轻度，未经处理1～2周后恢复正常。

3 讨论

本研究建立选择性好、灵敏度高、高通量的LC-MS/MS法测定人血浆中替米沙坦，并进行了系统的方法验证。沉淀蛋白前处理方法简单快速，优化后的色谱条件极大缩短了检测时间，每个样本分析仅需2.2m in，提高了工作效率。本方法血浆用量少（仅50μL），定量下限（LLOQ）为1.00 ng·m L－1，定量上限定为1 500 ng·m L－1，线性范围较宽，能够满足替米沙坦片的人体药动学研究及生物等效性研究的需要。

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