RP-HPLC法测定变通丸中盐酸小檗碱的含量Δ

李明月，杨惊宇，刘西京，倪建新，蔡昌龙(.广东东莞市塘厦医院，东莞市57；.广东深圳市宝安区中医院，深圳市58；.广东深圳市宝安区人民医院，深圳市58)

药对是中药配伍中的最小单位，为历代医药学家所重视。黄连-吴茱萸药对的应用历史悠久，临床根据不同情况，经常变换黄连-吴茱萸的配伍比例，达到辩证论治的目的，有左金丸(6∶1)、变通丸(又叫茱萸丸，1∶1)和反左金丸(1∶6)等，均通过改变该药对配伍比例而来，常用于脾胃功能失调有关的疾病[1，2]。其中，变通丸原方早在北宋《太平圣惠方·治水泄诸方》中就有记载，由黄连和吴茱萸按1∶1组成，主治虚寒型下痢水泻。目前研究表明，黄连中有效成分为小檗碱型生物碱，具有抗病原微生物等作用[3]。笔者在参照文献[4～8]的基础上，建立了以反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定变通丸中盐酸小檗碱含量的方法。

1 仪器与试药

2695-2998 HPLC仪，包括Waters色谱工作站、紫外检测器(美国Waters公司)；CPA225D电子天平(德国Sartorius公司)。

盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110713-200910)；变通丸(深圳市宝安区中医院自制，批号:20101111、20101201、20101224)；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:SunFireTMC18(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)；流动相:1.5 mmol·L-1十二烷基硫酸钠溶液(A，以磷酸调pH 5.0)-乙腈(B)，梯度洗脱(0 min，A∶B＝65∶35；10 min，A∶B＝50∶50；20 min，A∶B＝25∶75)；检测波长:265 nm；流速:0.8 mL·min-1；柱温:25℃；进样量:10 μL。

2.2 供试品溶液的制备

取变通丸粉末约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸-甲醇(1∶100)50 mL，称定重量，冷浸1 h后加热回流1 h，放冷，再称定重量，用盐酸-甲醇(1∶100)补足减失的重量，摇匀，以微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取盐酸小檗碱对照品15.20 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含盐酸小檗碱304 μg·mL-1的对照品贮备液。再精密量取此贮备液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得盐酸小檗碱系列对照品溶液。

2.4 阴性对照溶液的制备

取吴茱萸药材，按制剂工艺制备阴性样品，按“2.2”项下方法制成缺黄连的阴性对照溶液。

2.5 系统适用性试验

在“2.1”项下色谱条件下，分别精密吸取对照品贮备液、供试品溶液、缺黄连的阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果，盐酸小檗碱峰的保留时间约为15 min，阴性对照色谱在此处无假阳性峰，表明其他组分对测定无干扰；盐酸小檗碱峰与相邻峰的分离度＞1.5。理论板数按盐酸小檗碱峰计算应≥4000。色谱见图1。

2.6 线性关系考察

在“2.1”项下色谱条件下，精密吸取上述系列对照品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪中，测定峰面积。以峰面积积分值(Y)为纵坐标，质量浓度(X，μg·mL-1)为横坐标，进行线性回归，得回归方程为Y＝1E+06X+56513(r＝0.9998)。结果表明，盐酸小檗碱的质量浓度在60.8～304.0 μg·mL-1范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.7 精密度试验

在“2.1”项下色谱条件下，精密吸取对照品溶液(121.6 μg·mL-1)10 μL，连续进样6次，测定。结果，盐酸小檗碱峰面积的RSD＝0.85%(n＝6)，表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验

取同一批样品适量，共6份，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件各进样1次，测定。结果，盐酸小檗碱含量的RSD＝1.25%(n＝6)，表明此方法重复性良好。

2.9 稳定性试验

在“2.1”项下色谱条件下，对同一供试品溶液于制备后0、4、8、12、24 h进样，每次10 μL，测定。结果，盐酸小檗碱峰面积的RSD＝1.04%(n＝5)，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.10 加样回收率试验

取已知含量的样品粉末0.1 g，精密称定，共6份，分别置50 mL容量瓶中，分别精密加入盐酸小檗碱对照品溶液适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定，结果见表1。

2.11 样品含量测定

取变通丸3批，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行含量测定，计算。结果，3批样品(批号:20101111、20101201、20101224)中盐酸小檗碱的含量分别为8.06、8.54、8.38 mg·g-1。

表1 加样回收率试验结果(n＝6)Tab 1Results of recovery tests(n＝6)

3 讨论

3.1 检测波长的选择

将盐酸小檗碱对照品溶液在210～400 nm波长范围内进行光谱扫描，结果显示其在230、265、345 nm波长处有较大吸收且吸收曲线平滑。综合考虑并参考有关文献[4，5]，选择265 nm为检测波长。

3.2 流动相的选择

盐酸小檗碱主要以阳离子形式存在，易与固定相中硅羟基较牢结合，形成拖尾。在考察了乙腈-水比例、十二烷基硫酸钠浓度及流动相pH值对分离的影响后发现，将流动相调整为1.5 mmol·L-1十二烷基硫酸钠溶液(以磷酸调pH 5.0)-乙腈(梯度洗脱)时分离情况良好，既避免了盐酸小檗碱峰的拖尾现象，又使得样品中各杂质峰能与盐酸小檗碱峰有效分离。

3.3 供试品制备方法考察

在参考相关文献[6～8]的基础上，对影响供试品溶液制备的主要因素[提取方法(加热回流、超声处理、连续回流提取)、提取时间(0.5、1.0、1.5 h)]进行了考察，最终优化并确定了本文所述供试品溶液制备方法。

本试验建立了以RP-HPLC法测定变通丸中盐酸小檗碱含量的方法。试验结果表明，本法简便、快速、重复性好，结果准确、可靠，可用于变通丸的质量控制。

[1]张军会，左金丸不同配伍配比的临床应用[J].云南中医学院学报，2007，30(4):49.

[2]杨威，金香兰，于有华，等，黄连与吴茱萸配伍比例关系与功能关系的相关性分析[J].中国中医基础医学杂志，2003，99(11):49.

[3]崔学军，黄连及其有效成分的药理研究进展[J].中国药师，2006，9(5):469.

[4]卢荣枝，李嫦珍，李运景，等.RP-HPLC法测定妇洁洗剂中小檗碱的含量[J].中国药房，2010，21(27):2539.

[5]苏松柏，张永萍.采用高效液相色谱法测定黄连中盐酸小檗碱含量[J].贵州中医学院学报，2010，32(5):14.

[6]国家药典委员会编.中华人民共和国药典(一部)[S].2010年版.北京:中国医药科技出版社，2010:630.

[7]韩风梅，李宇，李路军，等.反相离子对液相色谱法测定左金丸中盐酸小檗碱和吴茱萸次碱含量[J].分析化学，2005，33(11):166.

[8]李宁，韩风梅，柳伟，等.反相高效液相色谱法测定加味左金丸中盐酸小檗碱和吴茱萸次碱的含量[J].中国药学杂志，2006，41(8):631.