中药联合FTS抗大鼠梗阻性黄疸肝脏缺血再灌注损伤的研究

张 军 傅永清 华 晨 陈炳荣 裘华森 王海娜 周 剑浙江中医药大学附属第一医院 杭州 310006

快速康复外科（fast-track surgery，FTS），最早由丹麦外科医生Kehlet等提出[1]，它是指在术前、术中及术后应用各种已证实有效的方法以减少手术应激[2]。FTS已被证实在缩短住院时间、降低术后并发症的发生率、死亡率、返院率及医疗费用等方面较传统方法有明显的优势。快速康复计划已在外科许多疾病中成功应用，其中结直肠切除手术的快速康复外科治疗方案是其中较为成功的典范之一[3]，近年来国际上在心脏外科、泌尿外科、妇科中开展快速康复外科治疗也见报道[4]。快速康复外科可以减少应激反应，促进患者术后快速康复[5]。然而肝胆外科中运用快速康复外科理念的研究论文仍较少见。本研究将中药联合快速康复外科治疗手段作为干预因素，研究在梗阻性黄疸基础上FTS对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康SD大鼠60只（由浙江中医药大学动物实验研究中心提供），雌雄各30只，7周龄，体重（200±40）g。随机分为假手术组、非 FTS 组、FTS常规组及FTS+中药组，每组各15只。

1.2 药品及试剂 3%戊巴比妥钠（美国sigma公司，批号 P376）；四君子汤（党参 12g，茯苓 9g，白术9g，甘草6g，购自浙江省中医院，由其代煎为浓缩剂）；AST、ALT试剂盒（上海申能德赛技术有限公司，批号27016，26013）；苏木精、伊红染剂（浙江中医药大学动物实验研究中心提供）；原位细胞凋亡检测试剂盒（美国罗氏公司，批号11342000）。

1.3 主要仪器 移液器、天平、DU800分光光度仪、组织匀浆机等均由浙江中医药大学动物实验研究中心提供。

2 实验方法

2.1 模型建立 所有大鼠均行胆总管结扎（common bile ductligation，CBDI）制备为梗阻性黄疸模型，方法如下：大鼠按每100g体重0.13mL剂量的3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，取上腹部正中切口2～3cm，在距肝门0.5cm处用4-0丝线双道结扎胆总管后关腹。所有操作均严格按照无菌原则进行。

2.2 实验方法 本实验研究共设置5个干预因素，分别是：术前禁食、禁水12h；术前生理盐水灌肠1次；术中放置腹腔引流管；术后生理盐水灌胃1次；术后禁食6h。以上干预措施在两FTS组大鼠均不实施。FTS+中药干预组予中药2mL分别于术前1天、手术当天及术后1天灌胃1次，FTS常规组则不进行该操作。模型制备后第7天，进行第二次手术。假手术组仅进行开腹、关腹操作。非FTS组及两FTS组均进行肝脏缺血再灌注操作。采用5-0血管缝线结扎门静脉，缺血40min，再灌注时抽掉血管缝线再次开放门静脉，术后予常规补液治疗。

2.3 标本采集及检测 开放门静脉24h后，3%戊巴比妥钠溶液麻醉（0.13mL/100g），5mL注射用针筒大鼠心脏取血，打开腹腔，用剪刀剪取肝脏组织约5g左右。

2.4 检测指标及方法

2.4.1 ALT、AST检测 血液样本3 000r/min离心10min分离取血清，用全自动生化分析仪检测AST、ALT水平，具体步骤按照试剂盒说明进行操作。

2.4.2 HE染色及TUNEL检测 肝脏组织进行常规HE染色，TUNEL法检测肝组织细胞原位凋亡，具体操作方法：切片置60℃烤箱烘烤2h；切片脱蜡；蒸馏水洗2min；高压热修复：高压锅内放适量自来水，将修复液倒入烧杯内，将烧杯置于高压锅内煮沸，将切片放入装有修复液的烧杯内，盖紧高压锅，加热至设定压力冒气后持续2min，自来水冷却；3%H2O2溶液阻断过氧化物酶，10min；蒸馏水洗 2min，PBS洗3min；滴加一抗，37℃孵育 1h；流水冲洗 3min，蒸馏水洗 3min，PBS 洗 5min；滴加二抗，37℃孵育 60min；流水冲洗3min，蒸馏水洗3min，PBS洗 5min；DAB显色2min；复染、透明后封片。HE染色下观察大鼠肝细胞形态学变化，免疫组化染色后观察各组肝脏细胞凋亡情况，计算凋亡指数（Apoptosis Index，AI）。判断标准：以光镜下观察到肝脏细胞核呈棕色或棕褐色为原位凋亡细胞，光镜下随机选取5个视野，计数平均200个细胞中的阳性细胞数，以百分数表示。

3 实验结果

3.1 各组大鼠血清ALT、AST水平 假手术组与FTS+中药组、FTS常规组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；假手术组与非FTS组比较，AST、ALT值后者明显高于前者（P＜0.05）；非 FTS组与 FTS+中药组及 FTS常规组比较，AST、ALT值后两者明显低于前者（P＜0.05）；FTS+中药组与 FTS 常规组比较，AST、ALT 值后者明显高于前者（P＜0.05），见表1。

表2 各组大鼠肝脏细胞凋亡阳性指数比较（±s）

表2 各组大鼠肝脏细胞凋亡阳性指数比较（±s）

注：与假手术组比较，▲P＜0.01；与非 FTS 组比较，△P＜0.05

组 别 n/只 阳性指数/%假手术组 15 7.48±1.08非 FTS组 15 19.60±1.72▲FTS+中药组 15 14.90±1.18▲△FTS 常规组 15 15.75±2.19▲△

表1 各组大鼠血清ALT、AST水平比较（±s）IU/L

表1 各组大鼠血清ALT、AST水平比较（±s）IU/L

注：与非 FTS 组比较，△P＜0.05；与 FTS 常规组比较，*P＜0.05

组 别 n/只 ALT AST假手术组 15 224.6±120.9△ 858.2±80.0△非 FTS 组 15 459.0±233.1 1237.8±202.5 FTS+中药组 15 149.7±72.5△* 711.0±245.7△*FTS常规组 15 270.1±112.1△ 955.6±156.3△

3.2 大鼠肝脏HE染色形态学比较 在200倍光镜下，各组均存在肝细胞变性坏死，表现为细胞核胀大，水样变，核分裂等，非FTS组出现局部片状坏死区，肝小叶中央静脉周围更加明显；两FTS组基本肝小叶结构保持完好。

3.3 大鼠肝脏细胞凋亡情况 各组均可见肝脏细胞凋亡，见图1～4（封四），非FTS组及两FTS组肝脏细胞凋亡程度明显高于假手术组。假手术组凋亡指数显著低于其他各组（P＜0.01），非FTS组高于两FTS组（P＜0.05），FTS+中药组与FTS常规组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

4 讨论

对胆汁淤积性黄疸患者进行肝脏手术造成缺血再灌注损伤，是导致患者术后短期内肝功能衰竭的主要原因。肝细胞的凋亡是肝脏缺血再灌注损伤的重要病理特征，细胞凋亡是细胞死亡的一种方式，直接反应了肝功能损害程度。大量肝细胞短期内凋亡势必会造成肝功能失代偿，甚者可发展为肝衰竭。

本实验研究选取术前禁食、禁水12h，术前生理盐水灌肠1次，术中放置腹腔引流管，术后生理盐水灌胃1次，术后禁食6h作为常规外科操作手段，比较研究FTS在胆汁淤积性黄疸大鼠肝脏缺血再灌注损伤中的干预作用，选取四君子汤作为独立干预因子。结果显示，各组间大鼠血清ALT、AST水平相互比较，假手术组与FTS+中药组、FTS常规组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；非 FTS组 AST、ALT 明显高于假手术组（P＜0.05）；非 FTS组 AST、ALT 明显低于FTS+中药组及 FTS 常规组（P＜0.05）；FTS+中药组AST、ALT 明显高于 FTS常规组（P＜0.05）。在肝脏细胞形态方面，FTS组肝细胞变性坏死情况好于非FTS组，而在肝细胞凋亡方面，假手术组显著低于其他各组（P＜0.01），非 FTS组高于两 FTS组（P＜0.05），FTS+中药组与FTS常规组无明显差异（P＞0.05）。由此初步推测，FTS的因素干预，可减少肝细胞凋亡，降低肝功能的损伤程度。

四君子汤由人参、白术、茯苓、甘草四药组成，功效健脾益气，主治脾胃气虚之证，该方用于外科手术患者术后元气大伤，正气不固，可以固正抗邪，降低术后创伤，促进患者术后康复。

[1]Wilmore DW，Kehlet H.Management of Patients in fast track surgery[J].BMJ，2001，322（7284）：473-476.

[2]江志伟，李宁，黎介寿.快速康复外科的概念及临床意义[J].中国实用外科杂志，2007，27（2）：131-133.

[3]Wang G，Jiang ZW，Bao Y，et al.Clinical use of fast-tracksurgery in colorectal cancer patients：report of 116 cases[J].Zhonghua Wei Chang Wai Ke Za Zhi，2010，13（5）：342-345.

[4]Svircevic V，Nierich AP，Moons KG，et al.Fast-track anesthesia and cardiac surgery：a retrospective cohort study of 7989 patients[J].Anesth Analg，2009，108（3）：727-733.

[5]李志春，徐鹏远.加速康复外科在肝胆外科的应用价值[J].昆明医学院学报，2009，（3B）：231-234.