1型糖尿病大鼠认知功能和细胞色素C蛋白表达改变实验研究

阮丽丽 杭州市红十字会医院神经内科 杭州 310003

糖尿病性脑病变是糖尿病常见的慢性并发症之一，主要表现为认知功能障碍、认知力减弱、智力降低、情感障碍等。本实验应用链脲佐菌素（STZ）制备1型糖尿病模型大鼠，观察糖尿病大鼠的认知功能，以及大鼠海马组织细胞色素C（Cyt-c）蛋白表达的改变，探讨糖尿病对认知功能的影响及其机制，现报道如下。

1 实验材料

1.1 动 物 SD雄性大鼠20只，体质量140～180g，SPF级，由浙江大学医学院动物实验中心提供（SCXK[浙]2003—0001）。

1.2 主要仪器 One-Touch-Ⅱ型快速血糖仪及血糖试纸（美国强生公司）；Morris水迷宫及分析软件（浙江大学药学院药物研究所）；WFZ800-3型紫外可见单光束分光光度计（北京瑞利光学仪器厂）；分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司产品）；电泳仪（BIORAD，Power PAC200）；电泳湿转仪（BIO-RAD，Trans-Blot SD）。

1.3 主要试剂 链脲佐菌素（STZ）、Cyt-c及GAPDH抗体（Santa Cruz公司）；山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物试剂公司）；Western blotting相关试剂（碧云天生物技术研究所）。

2 实验方法

2.1 模型建立 20只大鼠用随机数字表随机分为正常组、实验组各10只。两组大鼠均予标准鼠食饲养，并给饮5%葡萄糖溶液。实验组大鼠禁食24h，按60mg/kg腹腔注射链脲霉素（pH 4.4柠檬酸缓冲液配制，置于冰浴备用）。第4天尾部采血以One-Touch-Ⅱ型快速血糖测定仪测每只大鼠空腹血糖，血糖＞15mmol/L大鼠为造模成功。30天后，进行Morris水迷宫测定，处死后取大脑海马组织进行细胞色素C蛋白测定。

2.2 Morris水迷宫测定方法 主要由圆形水池和自动摄象及电脑分析系统组成。水池上方的摄像机同步记录大鼠的运动轨迹。测试前将水注入池中，水深30cm（即水面高出站台表面1cm，使大鼠不能见到站台），放入碳素墨水使之成为黑色，水温22～25℃。实验时要求各种实验条件保持不变。每只动物第1天训练2次，使之学习并产生记忆，入池位置为站台的对象限及邻象限，于象限边1/2弧度处将动物头朝池壁入水，120s未找到站台者，将其引至站台，放置30s引导其学习与记忆。试验共进行5天，前4天为训练时间，第5天测试。数据采集及图像分析均由图像自动监视和处理系统完成。观察指标：观察120s内找到平台的时间（潜伏期）；搜寻平台的策略（直线式，记分4分；趋向式，记分3分；随机式，记分2分；圆圈式，记分1分）。

2.3 大鼠海马组织细胞色素C（Cyt-c）蛋白测定 取单侧海马组织200mg加入含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液，4℃匀浆后10000g离心15min，上清蛋白定量后，取50μg蛋白，变性，行聚丙酰胺凝胶电泳，转移至硝酸纤维膜，6%脱脂奶粉室温封闭1h，4℃过夜，洗涤后膜和兔抗鼠 Cyt-c抗体（1∶1 000）作用，4℃过夜，洗涤后加入辣根过氧化酶结合的抗兔IgG（1∶5 000），化学发光试剂检测，X线片显影；将目的蛋白发光后的NC膜用strip液将一抗洗脱，结合内参GAPDH（1∶2 000），余步骤同前。定量分析采用分子生物学图像分析系统测定各目的条带积分灰度值，所测结果为目的条带除以内参条带灰度值的比值。

2.4 统计学方法 采用SPSS13.0软件包对实验数据进行方差分析，计量资料先行方差齐性检验。方差齐性采用LSD-t检验；若方差不齐，则采用Tamhane’St检验。

3 实验结果

3.1 Morris水迷宫潜伏期与搜索策略检测结果 实验第5天，实验组大鼠潜伏期比正常组明显延长（P＜0.01），搜索策略明显劣于正常组（P＜0.01），见表1。

表1 两组Morris水迷宫第5天潜伏期和搜寻平台策略结果比较

3.2 大脑海马组织Cyt-c蛋白表达 Western blotting结果显示，正常组Cyt-c蛋白表达量0.65±0.21，实验组为 1.13±0.42，实验组较正常组明显升高（P＜0.05）。

4 讨论

有研究表明，糖尿病与认识功能障碍有密切联系[1]，糖尿病脑病患者主要表现轻、中度认知功能障碍。由于这些表现并不十分严重或缺乏对这方面的了解而常被忽视。对动物的认知过程一般从行为学、电生理、脑成像、组织化学及分子生物学等方面进行分析。本实验采用的Morris水迷宫就是一种分析行为学方法。正常动物在经过3～4个实验日训练后，很快就学会以最快、最佳的速度和策略搜索到站台确切位置；如果破坏海马系统，可使动物的反应时间延长，搜索目标的轨迹混乱，由此可检验脑的某结构对空间认知的影响[2]。本实验结果表明，与正常组比较，糖尿病大鼠潜伏期明显延长、搜索策略明显变差，说明糖尿病大鼠存在着空间学习记忆障碍，提示该认知功能障碍可能与海马功能受损有关。

Christelle等[3]报道糖尿病是引起Alzheimer病（AD）的一个高危因素。神经元细胞的死亡是AD的一个特征，而细胞的死亡与细胞凋亡密切相关。糖尿病时细胞凋亡增加可能与糖尿病引起的高血糖有关[4]。Brownlee等[5]提出，高血糖引起线粒体中超氧阴离子生成过多，导致组织细胞发生氧化应激，使机体处于易损状态，线粒体膜通透性发生改变。Cyt-c是线粒体呼吸链中传递电子的载体，由核基因编码的多肽和线粒体编码的亚铁血红素组成，松散地结合在富含不饱和脂肪酸的线粒体内膜外侧心磷脂上，不能自由通过线粒体外膜。目前，Cyt-c促进细胞凋亡作用正逐步阐明[6]，当凋亡刺激因子引起线粒体膜通透性发生改变，Cyt-c从间隙释放到胞浆后，首先与胞浆中的凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）结合，聚合成为复合体，继而启动caspase-9形成全酶，然后裂解，最后导致caspase-9前体自动活化，活化的caspase-9分裂，继续激活下游的capases成员，诱导细胞发生凋亡[7-8]。坏死和凋亡虽然为细胞死亡的两种方式，但两者发生过程中的某些环节可能重叠，如线粒体膜通透性的改变[9]。本实验结果显示，正常大鼠海马组织中Cyt-c表达很少，糖尿病大鼠Cyt-c表达明显增多。我们认为，造模后，高血糖引起线粒体膜通透性发生改变，释放出Cyt-c并结合至核膜，诱导DNA裂解，进入非caspase依赖性细胞凋亡过程[10]；Cyt-c同时也对下游caspase进行活化，进入caspase依赖性细胞凋亡过程，导致细胞凋亡[11]。以上过程导致糖尿病大鼠海马组织中Cyt-c表达较正常大鼠明显增加，与实验结果相符。本实验结果说明，糖尿病时高血糖引起海马组织Cyt-c表达增加，从而导致神经元细胞凋亡增加，进而导致海马功能受损，引起认知障碍。

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