抗蓝舌病病毒VP7和NS2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

秦永丽， 孙恩成，耿宏伟,2，杨 涛，刘霓红，赵 晶，王凌凤，徐青元，蔡绪禹，李文京，吴东来*

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室，黑龙江哈尔滨150001；2.东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨150030；3.中国动物疫病预防控制中心，北京100125)

蓝舌病(Bluetongue，BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属的BT病毒(BTV)引起的，主要由库蠓传播的反刍动物烈性非接触性传染病，其主要感染牛、羊和野生反刍动物等[1]。感染动物的平均病死率为30%，其中绵羊的病死率可高达80%[2]。世界动物卫生组织(OIE)将BT列为必须呈报的传染病之一，我国将其划定为一类动物疫病。BTV血清型众多，目前已发现24个血清型，根据不同的地理位置又分为不同的亚型[3]。

BTV是双链RNA病毒，其基因组由10个线性双链RNA片段组成，共编码10种蛋白，包括7种结构蛋白(VP1-VP7)和4种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3和NS3a)。自2006年以来，BTV8在欧洲一些国家如比利时、荷兰、法国、德国等爆发，造成了严重的经济损失，同时也扩大了BTV的传统分布范围[4]。我国目前还未有BTV8流行的相关报道，但是随着国际贸易的往来，BTV8随时有可能传入我国。所以，本研究利用BTV8全病毒颗粒为免疫原免疫BALB/c小鼠制备了单克隆抗体(MAb)，并通过western blot和间接免疫荧光(IFA)对其特性进行鉴定，为建立BTV免疫学检测方法和相关病毒蛋白功能的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 细胞与病毒株 BHK-21细胞、SP2/0骨髓瘤细胞以及BTV1-24型病毒株由本实验室保存。

1.2 实验动物 6周龄～8周龄的BALB/c小鼠由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

1.3 主要试剂 胎牛血清、DMEM培养基购自GIBCO公司；PEG4000、HAT、HT、FITC标记羊抗鼠IgG抗体购自Sigma公司；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；邻苯二胺(OPD)购自哈尔滨博瑞生物技术有限公司；预染蛋白Marker购自Fermentas公司；MAb亚型鉴定试剂盒购自Invitrogen公司。

1.4 BTV8增殖和TCID50测定 将第7代BTV8接种单层BHK-21细胞，于37℃、5%CO2条件下培养，72 h后待90%的BHK-21细胞产生病变时收集细胞及培养上清，离心除去细胞碎片，将收集的上清进行TCID50测定，确定BTV8病毒毒价[5]。

1.5 间接ELISA检测方法的建立 按常规间接ELISA操作步骤，分别用BTV8全病毒和BHK-21作为包被抗原，经方阵法确定抗原最佳包被浓度和阳性血清的最佳稀释倍数。

1.6 动物免疫 将BTV8全病毒腹腔注射免疫6周龄～8周龄的BALB/c雌鼠5只，0.5 mL/只。每隔两周进行一次免疫，共免疫3次。分别在第2次和第3次免疫后一周断尾采血，以建立的ELISA方法检测血清效价。选取血清效价最高的小鼠在融合前3 d腹腔注射进行加强免疫。

1.7 细胞融合及MAb的制备 按常规方法进行细胞融合。待杂交瘤细胞生长至板底面积1/4～1/3后，用BTV8全病毒为包被抗原通过间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株，同时将BHK-21细胞反复冻融3次，离心，以收集上清液为包被抗原作为阴性对照。对初步筛选的阳性克隆根据有限稀释法进行3次亚克隆。最后将得到的稳定分泌特异性MAb的阳性杂交瘤细胞株进行扩大培养，并将细胞冻存。收集上清液进行western blot及IFA检测，并对其生物学特性进行鉴定。

1.8 MAb免疫球蛋白亚类鉴定 按照MAb亚类试剂盒说明书用ELISA方法进行检测。

1.9 Western blot鉴定 将离心收获BTV8病毒上清液后的细胞沉淀和BHK-21细胞沉淀处理后进行SDS-PAGE电泳，电转印至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭液4℃封闭过夜。加入MAb上清室温孵育1 h，用PBST洗涤3次，再与4000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体室温孵育1 h，PBST洗涤3次后，用DAB显色试剂盒显色，扫描记录。

1.10 IFA鉴定 将BTV1-24型病毒株分别接种于单层BHK-21细胞，待细胞出现病变时，弃掉培养液，加入70%预冷的无水乙醇，4℃固定30 min，用PBST洗涤3次。分别加入阳性、阴性鼠血清和MAb上清，同时设置未接种病毒细胞对照，37℃孵育1 h。以FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗，37℃避光孵育1 h。镜检，拍照。

2 结 果

2.1 BTV8培养和TCID50测定 将BTV8第7代病毒液接种于单层BHK-21细胞，获得BTV8第8代病毒。按照文献[5]的方法进行TCID50测定，得到BTV8 TCID50为 10-8.25/0.1 mL。

2.2 间接ELISA方法的建立 经方阵试验确定ELISA方法的最佳反应条件：最佳的抗原包被浓度为10-7.25TCID50，4℃反应过夜；5%脱脂乳37℃封闭2 h，阴阳性血清的稀释倍数为1∶1600；一抗(MAb上清)和羊抗鼠IgG二抗(1∶5000稀释)均为37℃孵育1 h；底物显色10 min。

2.3 MAb的制备 细胞融合后，初步检测为阳性的细胞克隆经过3次亚克隆后，共获得8株稳定分泌抗BTV8 MAb的阳性杂交瘤细胞株，分别命名为1B2、1F6、2B1、2D10、3B6、3D9、4D4 和 4D12。用上述间接ELISA方法测定杂交瘤细胞株培养上清的效价(表 1)。

2.4 MAb免疫球蛋白亚类鉴定 经MAb亚类鉴定试剂盒检测，MAb 1B2、2B1、3D9、3B6、4D4亚类为 IgG1/κ 链；MAb 1F6、2D10、4D12亚类为IgG2a/κ 链(表 1)。

表1 MAb的特点Table 1 The characterization of MAb

2.5 Western blot鉴定 用8株杂交瘤细胞培养上清进行western blot鉴定，结果表明，本研究所获得的 MAb1F6、2B1、2D10、3B6、3D9 与 BTV8 VP7蛋白反应，MAb B2、4D4、4D12与BTV8 NS2蛋白反应。所有MAb均不与对照BHK-21细胞沉淀发生反应(图 1)。

2.6 IFA鉴定 用 1B2、1F6、2B1、2D10、3B6、3D9、4D4、4D128株杂交瘤细胞培养上清液对接种BTV1-24型病毒株的单层BHK-21细胞以及未接种病毒的BHK-21细胞进行IFA试验，结果显示这8株MAb与不同血清型的BTV反应谱系有所不同(表 2)。

MAb 1B2、4D4、4D12可以与24个不同血清型BTV发生反应，而其他MAb对不同血清型的BTV反应性不 同，如 MAb 1F6与 BTV1、BTV7、BTV12、BTV13、BTV21呈弱阳性反应，与BTV5、BTV6、BTV17呈阴性反应；MAb B1与BTV7呈阴性反应；MAb D10、3D9、3B6与 BTV7、BTV15、BTV19呈阴性反应。

表2 IFA鉴定结果Table 2 The results of the identification of IFA against BTV

3 讨论

近年来，随着气候变暖，BTV在全球范围内普遍流行，新的血清型不断出现[7-8]。覃绍敏等对广西山羊BT血清学调查发现该地区山羊BTV感染现象普遍存在，阳性率为6.3%～45.1%，平均阳性率为20.5%[9]。目前国内外还没有能够对BT进行有效的防制的疫苗，所以提高BT的诊断技术是非常重要的。MAb是重要的免疫学工具，其在病原的生物学特性、抗原性的研究及病原的检测、治疗、免疫机制研究等方面均有重要的应用价值。所以，本研究利用目前在欧洲各国流行的BTV8全病毒颗粒为免疫原，同时用其作为包被抗原筛选出10株稳定分泌抗BTV8 MAb的杂交瘤细胞株，经鉴定这10株MAb效价高，生物学反应特性各异，为今后BTV分子生物学特性研究及建立BTV免疫学检测方法奠定了基础。

BTV基因组编码7种结构蛋白(VP1-VP7)和4种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3和NS3a)。VP7蛋白具有群特异性抗原决定簇，可以产生群特异性抗体，为BTV群特异性血清抗体检测中的首选抗原[10]。但本研究通过IFA检测表明与非结构蛋白NS2反应的MAb 1B2、4D4、4D12同样可以与BTV1-24型血清型发生反应，表明NS2蛋白也可以产生群特异性抗体，即同时证明He Cheng-qiang等的观点，即NS2在不同血清型中是相对保守的[11]。此外，NS2蛋白在BTV感染过程中表达量大并且具有良好的抗原性，这也为BT血清型的检测开辟了新的途径。

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