齐齐哈尔周边地区仔猪肠道乳酸杆菌的分离与鉴定

刘 宇

（黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

乳酸杆菌（Lactic acid bacteria, LAB）是仔猪肠道正常微生物区系中的优势菌群，可利用糖类发酵产生大量乳酸，有的还产生乙酸及其他挥发性脂肪酸，对致病菌具有很好的抑制作用，对维持仔猪肠道微生物区系平衡和消化机能起着重要作用。乳酸杆菌是指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性杆菌的总称。厌氧或兼性厌氧，大多数不运动，少数以周毛运动。菌体形态多样，直或弯的杆菌，通常单生或排列成链。

猪用益生菌制剂是一类通过改善猪肠道的微生态平衡对宿主动物产生有益作用的活菌制剂。我国应用的微生态制剂菌株大概有6种，即乳酸杆菌、乳酸链球菌、粪链球菌、芽孢杆菌、双歧杆菌和酵母菌。对于猪来说，猪的品种不同优势菌群也有差异。选择特异的优势菌株是研制猪用益生菌制剂的关键。

目前，乳酸杆菌配合其他益生菌制成的益生菌制剂已广泛应用于临床，替代抗生素预防和治疗仔猪消化道疾病，但效果好坏不一。由于动物肠道菌群存在动物种属和地域的特异性，一种适于某地域某类动物的微生态制剂不一定适于另一类动物。所以，本研究拟从齐齐哈尔周边地区健康仔猪肠道中分离筛选出乳酸杆菌，用来研制高效、专一的猪用乳酸杆菌微生态制剂。

1 材料与方法

1.1 材料2

1.1.1 样品来源

在齐齐哈尔周边地区部分猪场，选定21～35日龄长白、大白、杜洛克、二元及三元健康仔猪，用灭菌棉签蘸取刚排出的新鲜粪样，共采集粪样20份。置于灭菌试管中，冷藏并迅速送实验室进行细菌分离。

1.1.2 培养基

采用液体和固体MRS培养基（由北京陆桥技术有限责任公司生产），用于乳酸杆菌的分离培养。MRS液体培养基成分：蛋白胨10 g；牛肉浸膏10 g；酵母浸膏5 g；葡萄糖20 g；柠檬酸三铵2 g；醋酸钠5 g；K2HPO45g；MgSO4·7H2O 0.5 g；MnSO4·4H2O 0.2 g；吐温-80 1 g；蒸馏水加至1 000 mL。调pH值5.5～6.2，115℃灭菌20 min。在液体MRS中加入琼脂（1.8%～2%），为固体MRS。

1.1.3 生化管及试剂

细菌鉴定用生化鉴定管购自杭州天和微生物试剂有限公司，生理盐水，无水乙醇及甘油等均为分析纯试剂。

1.1.4 主要仪器设备

厌氧培养箱（YQX-Ⅱ型）；超静工作台（BCN-1360 B型）；电热恒温培养箱（DRP-9272型）；电热恒温水浴锅（DK-S12型）；电子天平 FA1104等。

1.2 方法

1.2.1 样品预处理

将采集的仔猪粪样置于盛有50 ml灭菌生理盐水含玻璃珠的锥形瓶中。将锥形瓶置于摇床振荡5 min（180 r/min），然后进行10倍系列稀释，自10-1至10-9，共9个稀释度。

1.2.2 菌株分离、染色和镜检

分别取10-7至10-9三个稀释度的粪样混悬液各0.l mL涂布于2块MRS平板，37℃恒温厌氧培养24～48 h。挑取各种不同菌落进行革兰氏染色，镜检，观察菌体形态。

1.2.3 菌株的纯化

挑取MRS琼脂培养基平板上的疑似菌落进行纯化，纯化好的菌株进行菌落形态观察，并描述各菌株的菌落形态特征。

1.2.4 分离菌生化鉴定

按照乳酸杆菌属和种的生理生化鉴定指标，分别进行厌氧生长试验、运动性试验，过氧化氢酶试验，硝酸盐还原试验，明胶液化试验，吲哚试验。若厌氧生长试验为阳性，其他均为阴性，可初步定为乳酸杆菌属。再进行糖醇类发酵产酸试验（阿拉伯糖、葡萄糖、葡萄糖酸盐、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、棉籽糖、甘露醇、松三糖、核糖、山梨醇、蔗糖、木糖、七叶苷、水杨素），结果与《伯杰细菌鉴定手册》和《乳酸细菌的分类鉴定及实验方法》对照，从而进行乳酸杆菌种的鉴定。

2 结果

2.1 菌落形态特征

通过厌氧分离纯化，共获得革兰氏阳性，无芽孢杆菌12株，其中菌株SY1和SY2菌落形态基本相同，均为圆形、边缘不整齐、表面粗糙、扁平、灰白色菌落，菌落直径1.0～2.0mm；菌株DYF3 和DYF4为圆形、边缘整齐、表面光滑、白色菌落，菌落直径1.0～2.0mm。

2.2 染色特性

对分离出的所有菌株进行了革兰氏染色，其中12株为革兰氏染色阳性无芽孢杆菌，长短不一，单个、成对、个别排列呈短链状。

2.3 菌株的生理生化鉴定结果

2.3.1 乳酸杆菌属的鉴定结果

通过厌氧生长试验、运动性试验，过氧化氢酶试验，硝酸盐还原试验，明胶液化试验，吲哚试验等7个鉴定指标，共4个菌株符合乳酸杆菌属的鉴别特征。可以初步确认为乳酸杆菌属。具体结果见表1。

表1 乳酸杆菌属鉴定结果

表2 乳酸杆菌种间生化鉴定结果

2.3.2 乳酸杆菌种间鉴定结果

乳酸杆菌种的鉴定主要是进行糖醇类发酵产酸试验，在本研究中共应用了15种糖醇。其中SY1和SY2两株乳酸杆菌有14种糖醇发酵产酸的鉴定结果符合嗜酸乳杆菌的鉴别特征，仅木糖不完全相符，可确定这2株乳酸杆菌为嗜酸乳杆菌；菌株SY3仅松三糖和甘露醇不完全符合干酪乳杆菌假植物亚种鉴别特征，可确定其为干酪乳杆菌；菌株SY4仅山梨醇不完全符合植物乳杆菌鉴别特征，可确定其为植物乳杆菌。具体结果见表2。

3 结论

在齐齐哈尔周边地区部分猪场采集的健康仔猪粪样中，共分离得到了乳酸杆菌4株。其中嗜酸乳杆菌2株，干酪乳杆菌1株，植物乳杆菌1株；

近年来，国内养猪业行情处于下降趋势，近半年来更是走入低谷，再加之饲养管理及众多猪病的影响，对养殖户经济收入造成了巨大的影响。而随着国家积极调控及养殖户的不断努力，相信养猪业行情在不久后会有所回暖。而众多的影响因素中，仔猪腹泻是影响猪只出栏时间，出栏重及料重比关键因素之一，目前，防治仔猪腹泻以使用抗生素为主，但长期、大量使用不仅造成药物残留，促进耐药菌株的产生，而且会打破宿主菌群平衡。益生菌制剂以其天然、无残留、安全可靠及不产生抗药性等优点而成为抗生素的替代品，是国内外研究的热点。本研究在齐齐哈尔周边地区部分猪场采集的健康仔猪粪样中分离乳酸杆菌，并通过形态学结合生理生化鉴定方法进行乳酸杆菌书间鉴定。结果表明，齐齐哈尔周边地区仔猪肠道中乳酸杆菌种类主要以嗜酸乳杆菌为主。

目前，国内一些猪用乳酸杆菌微生态制剂的生产菌株多是从人和哺乳动物肠道中或土壤中分离得到的，并非猪源乳酸杆菌制剂。由于动物肠道菌群的生成是长期进化的结果，一种适于某类动物的微生态制剂不一定适于另一类动物。此外，有研究结果表明，许多从鸡分离的乳酸杆菌只对鸡小肠粘膜上皮细胞有粘附力，而对大白鼠和猪等则没有粘附力。本研究鉴定得到的4株乳酸杆菌，均分离自齐齐哈尔周边地区健康仔猪肠道，具有地区特异性和物种特异性。通过安全性试验，耐受力试验及发酵条件等试验，进一步研究这些乳酸杆菌在不同生理环境中的特性，可筛选适合于生产猪源微生态制剂的乳酸杆菌菌株。为研发适用于齐齐哈尔市周边地区的猪用益生菌制剂提供科学依据。