β内酰胺抗生素头孢曲松对创伤性脑损伤大鼠海马谷氨酸盐水平的影响

潘向东，危 静，肖国民

(1.浙江省临安市中医院，浙江临安311300;2.杭州师范大学附属医院，浙江杭州310015)

创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)是40～50岁青壮年人群死亡和致残的第一病因［1］，预防和治疗TBI具有非常重要的临床意义。近30余年来，对TBI的病理机制和神经保护研究取得了较大成果，但至今仍未获得突破性进展［2］。谷氨酸盐是广泛存在于中枢神经系统的神经递质，维持着正常的神经生理活动。当脑损伤时谷氨酸盐过度释放，激活谷氨酸盐受体，导致细胞钙离子内流，引起钙介导的细胞酶活化，最终导致细胞死亡［3］。兴奋性神经毒性被认为是许多神经系统疾病病理发展过程中的共同通路［4］。因此，阻断谷氨酸盐神经毒性是治疗神经系统疾病的主要策略之一［5］。

谷氨酸盐由突触前膜和胶质细胞的谷氨酸盐转运体调控，谷氨酸盐转运体可摄取和贮存谷氨酸盐，维持脑内谷氨酸盐的稳定［3，6］。谷氨酸盐受体拮抗剂在动物实验中发现具有神经保护作用，但对与谷氨酸盐神经毒性有关的神经系统疾病无治疗效果［7］。因而，增强谷氨酸盐转运体活性，阻断和/或调控谷氨酸盐神经毒性已成为神经系统疾病治疗的一项重要策略。

近年研究发现，β-内酰胺抗生素不仅有抗菌作用，而且能激活谷氨酸转运体1的表达，具有阻断谷氨酸盐神经毒性作用［8-11］。在缺血性脑中风和肌萎缩侧索硬化动物模型中，头孢曲松有神经保护效果［7］;而TBI具有与缺血性中风等脑损伤疾病类似的病理过程。因而推测，头孢曲松有可能减轻谷氨酸盐的神经毒性。为此，本研究观察了头孢曲松对TBI大鼠谷氨酸盐水平的影响，以探讨头孢曲松对TBI的神经保护作用及其机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料与仪器设备 头孢曲松(ceftriaxone，CTX)为上海罗氏制药有限公司生产(批准文号:国药准字H10983036;产品批号:SH1195)。谷氨酸(glutamate，Glu)、天冬氨酸(aspartic acid，Asp)标准品由华美生物工程公司提供。还有WATERS600E高效液相色谱仪和Empower色谱数据工作站。

1.2 实验动物与分组 SD大鼠45只，雄雌不分，体重250～300 g。随机分成假手术对照组(Sham 组，9 只)、创伤组(TBI组，18 只)和创伤+CTX干预组(TBI+CTX组，18只)。每组又随机平分成术后3 h、12 h及24 h 3个小组。各组大鼠在相应时间点断头取脑。TBI+CTX组伤后立即腹腔注射CTX 200 mg/kg;Sham和TBI组按同样方法腹腔注射等容量生理盐水。

1.3 动物模型制作 TBI组和TBI+CTX组采用改良Feeney法制成脑外伤模型，由撞杆、下落锺、外周套管三部分组成一打击器。撞杆头端直径5 mm、高3 mm、击锺重20 g，下落高度30 cm。戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。俯卧固定头部，矢状切开头皮，显露右顶骨，在人字缝前2 mm，右侧中线旁2 mm用牙钻钻一小孔并扩大至5 mm×5 mm，撞杆头端置于右顶骨硬膜外，用击锺沿外周套管从30 cm高自由落下冲击撞杆，造成右顶叶局限性脑损伤，止血后缝合头皮。Sham组仅切开头皮，打开骨窗，不致伤。

1.4 大鼠海马Glu和Asp测定 伤后12 h取大鼠海马组织，称重，加入0.4 mol/L的高氯酸溶液内(即每100 mg脑组织加0.4 mol/L的高氯酸1.0 ml)。在冰浴下充分匀浆15 min，冰浴沉淀 30 min，于 4℃、10 000 r/min离心 15 min，取上清液，每1 ml上清液加4%的碳酸氢钠溶液 0.75 ml，混匀后，于 4℃、3 000 r/min 离心5 min，取上清液，于-75℃保存待用。采用邻苯二甲醛柱前衍生高效液相荧光色谱法［12］检测大鼠海马Glu和Asp含量。

1.5 脑组织含水量测定 伤后3 h、12 h及24 h分别取脑伤灶后缘约2 mm处脑皮层一块，约5 mm×5 mm×5 mm大小，电子天平称湿重后，置于真空恒温干燥箱，100℃烘烤24 h称干重。按Elliot等方法计算脑组织含水量。

1.6 病理形态学观测 伤后24 h取脑，立即经40 g/L中性甲醛固定，梯度酒精脱水，常规石蜡包埋，在海马齿状回互包平面作石蜡切片，片厚5 pm，HE染色。低倍镜下观察海马CAl区内锥体细胞带的厚度，高倍镜下观察海马CAl区存活锥体细胞情况。

1.7 统计学处理 采用SPSS统计软件11.5，所得数据均以±s表示，多组均数比较采用单因素方差分析，两两组间比较采用q检验。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑组织含水量 3组大鼠不同时间点(3、12和24 h)脑组织含水量比较(F=14.8732，P＜0.05)差异有统计学意义。其中，TBI组各时间点脑组织含水量均高于Sham组(P＜0.05);TBI+CTX组3个不同时间点脑组织含水量与Sham组比较差异无显著性统计学意义 (P＞0.05)，而与TBI组比较脑组织含水量明显减轻(P ＜0.05)，见表1。

表1 头孢曲松对创伤性脑损伤大鼠脑组织含水量的影响Table 1 Effects of ceftriaxone on brain tissue water in rats with traumatic brain injury(±s，%)

表1 头孢曲松对创伤性脑损伤大鼠脑组织含水量的影响Table 1 Effects of ceftriaxone on brain tissue water in rats with traumatic brain injury(±s，%)

与Sham组比较，*P＜0.05;与TBI组比较，▽P＜0.05.

组 别 n 伤后时间/h 3 12 24 Sham 9 68.45±5.21 70.65±1.41 69.91±8.25 TBI 18 76.69±6.83* 79.79±1.98* 89.50±5.03*TBI+CTX 18 69.97±4.06▽ 70.41±1.53▽ 70.51±1.36▽

2.2 大鼠海马Glu和Asp水平 伤后12 h，TBI+CTX组大鼠海马Glu水平明显低于TBI组(P＜0.05);TBI组海马Glu水平显著高于Sham组(P＜0.05);TBI+CTX组与Sham组比较无显著性差异(P＞0.05)。伤后12 h，TBI+CTX组大鼠海马Asp水平明显低于TBI组 (P＜0.05);TBI组海马Glu水平显著高于Sham组 (P＜0.05);与Sham组比较，TBI+CTX组海马Asp水平无显著性差异(P＞0.05)。见图1、表2。

图1 创伤+头孢曲松干预组大鼠海马高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of hippocampus glutamate in trauma+ceftriaxone group

表2 头孢曲松对创伤性脑损伤大鼠海马谷氨酸和天冬氨酸的影响Table 2 Effects of ceftriaxone on hippocampus glutamate in rats with traumatic brain injury(μmol·mg-1)

2.3 大鼠海马病理形态学 伤后24 h光镜下观察:Sham组可见海马CAl区细胞分布均匀、整齐，仅有少量神经元死亡。TBI组海马CAl区出现大量神经元死亡，表现为细胞碎裂、核固缩、溶解。TBI+CTX组海马CAl区神经元死亡明显少于TBI组(图2)。

3 讨论

根据目前对TBI病理机制的认识，理论上可以认为β-内酰胺抗生素同样有降低TBI后谷氨酸盐神经毒性的作用，对TBI具有神经保护作用。本实验观察到，β-内酰胺抗生素CTX可以使TBI大鼠海马CAl区神经元死亡明显减少，可以减轻TBI大鼠脑水肿。提示β-内酰胺抗生素CTX可能对TBI具有神经保护作用。同时，发现β-内酰胺抗生素CTX确实能降低TBI大鼠海马谷氨酸盐水平，这可能是CTX对TBI神经保护作用机制之一。

图2 大鼠海马CA1区锥体细胞(HE染色 ×400)Fig.2 Pathology slices of hippocampal CA1 pyramidal neurons(HE ×400)

β-内酰胺抗生素是1928年发明的抗菌素，是目前临床最广泛使用的抗菌药物之一，安全可靠，疗效确切，易通过血脑屏障，对中枢神经系统没有明显的毒性作用。目前临床上主要以抗菌药物用于预防和治疗TBI患者并发的感染。如果作为神经保护药物长期使用必然会产生耐药性和菌群失调，因此CTX并不适合成为一种神经保护剂。但进一步了解CTX神经保护作用分子机制，有助于研究针对此靶点的神经保护药物。另外，如能证实CTX对TBI有神经保护作用，可提醒临床医师在TBI患者治疗过程中，如需要选用抗生素，可首先考虑选用β-内酰胺抗生素，在抗菌治疗的同时也可产生神经保护作用。本次实验参照Lipski等［10］在脑缺血中风动物模型CTX的给药方法和剂量，大鼠致伤后立即一次性给予CTX 200 mg/kg，这种给药方式主要目的是初步验证CTX对TBI神经保护效果。β-内酰胺抗生素CTX是否对TBI有神经保护作用，目前尚不能完全证实，有待今后进一步研究。

［1］FINFER S R，COHEN J.Severe traumatic brain injury［J］.Resuscitation，2001，48(1):77-90.

［2］JAIN K K.Neuroprotection in traumatic brain injury［J］.Drug Discovery Today，2008，13(23-24):1082-1089.

［3］SHIGERI Y.Molecular pharmacology of glutamate transporters，EAATs and VGLUTs ［J］.Brain Res Rev，2004，45(3):250-265.

［4］JIANREN M.Glutamate transporter:an unexpected target for some antibiotics［J］.Molecular Pain，2005，1:5.

［5］BESSON V C.Drug targets for traumatic brain injury from poly(ADP-ribose)polymerase pathway modulation ［J］.Br J Pharmacol，2009，157(5):695-704.

［6］BOTTCHER T.Clindamycin is neuroprotective in experimental streptococcus pneumoniae meningitis compared with ceftriaxone［J］.J Neurochem，2004，91(6):1450-1460.

［7］KOLLER M，URWYLER S.Novel N-methyl-D-aspartate receptor antagonists:a review of compounds patented since 2006［J］.Expert Opin Ther Pat，2010，20(12):1683-1702.

［8］ROTHSTEIN J D，PATEL S，REGAN M R，et al.blactam antibiotics offer neuroprotection by increasing glutamate transporterexpression ［J］.Nature，2005，433(7021):73-77.

［9］CHU K，LEE S T，SINN D I，et al.Pharmacological induction ofischemic tolerance by glutamate transporter-1(EAAT2)upregulation ［J］.Stroke，2007，38(1):177-182.

［10］LIPSKIJ，WAN C K，BAIJZ，etal.Neuroprotective potential of ceftriaxone in in vitro models of stroke ［J］.Neuroscience，2007，146(2):617-629.

［11］LIU Chunhua，WANG Weizhi(刘春华，王维治).Effect of Cefteriaxone on neurotoxic of glutamic acid and its mechanism［J］.Chin J Nerv Ment Dis(中国神经精神疾病杂志)，2007，33(1):42-45.(in Chinese)

［12］ZHU Ling-ying，KONG Ming，PENG Ying-ru，et al(朱玲英，孔 铭，彭蕴茹，等).Study on the determination of glutamic acid and γ-aminobutyric acid in hippocampus of rat by HPLC ［J］.Chin J Modern Applied Pharmacy(中国现代应用药学)，2009，26(8):654-656.(in Chinese)