脂联素对高糖环境下人心肌细胞增殖及VEGF表达的影响

王保忠

（山西大同大学医学院内科教研室，山西 大同 037000）

糖尿病心肌病变是糖尿病主要的心脏并发症之一，其发病率高，危害性大。 糖尿病心肌病变由Ruble等于1972年首先提出，作为一种独立的糖尿病并发症，是一种特异的心肌疾病，主要表现为心室舒张功能障碍。其病理改变主要表现为心肌细胞肥大、变性、灶性坏死，肌丝纤维大量丢失，心肌细胞外间质有不溶性胶原蛋白积聚、纤维化，心肌细胞能量代谢紊乱、结构异常、功能改变、凋亡增加，促使心肌纤维化的细胞因子和炎性因子异常表达，其发病机制尚未完全明了。糖尿病心肌病是导致糖尿病死亡的主要原因之一[1]，延缓其病理进程，对改善预后，降低病死率有重要的临床意义。脂联素（Adiponectin，ADPN）是最近发现的一种由脂肪细胞分泌的特异蛋白质，有关数据显示ADPN与胰岛素抵抗有关，并具有抗炎和抗粥样硬化作用。临床和基础研究均表明，脂联素与心脏疾患发生、发展有密切关系。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是促进血管内皮生长和渗透的分子。多项研究认为糖尿病患者高血糖通过蛋白激酶C机制，促进VEGF的表达而参与糖尿病并发症的发生、发展。许多研究显示脂联素在心力衰竭和心室重构过程中起到重要作用[1,2]，具有心脏保护功能。但国内外关于脂联素对高糖环境中HCM增殖及VEGF表达的影响研究尚未见报道，本研究旨在探讨高糖环境下脂联素对HCM增殖及VEGF表达的影响，以揭示脂联素对高糖环境下人心肌细胞的可能保护机制，从而为预防、治疗糖尿病心肌病提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

人心肌细胞购于北方伟业发展有限公司，DMEM培养基、胰蛋白酶（美国Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青），D-2葡萄糖、MTT试剂盒（美国Sigma公司），脂联素Human gAcrp（Pep rotech），Trizol试剂（上海生工生物工程技术服务有限公司），引物：上游5’-AAACACAGACTCGCG TTGCA-3’、下游3’-GCCTCGGCTTGTCACATCT-5’，内参β-actin：上游5’-GGCACCCAGCACAATGAA-3’、下游3’-GGAAGGTGGACAGCGAGG-5’、探针FAMCGAGGCAGCTTGAGTTAAACGAACG-BHQ1（上海超世生物科技有限公司提供）

1.2 人心肌细胞的培养及分组

HCM培养于含10%胎牛血清、5.5mmol/L D-葡萄糖、100U/mL链霉素的DMEM培养液，并置于含5%CO2的37°恒温培养箱中孵育，每3～4d用0.25%胰酶消化传代，待细胞生长成亚融合状态时。取部分细胞以1×104/mL接种于96孔细胞培养板，待细胞贴壁后，改用无血清DMEM培养液使细胞同步化生长24h后，弃上清液，将其分为正常对照组（5.5mmol/L葡萄糖的DMEM培养液）、高糖组（30.0mmol/L葡萄糖的DMEM培养液）、脂联素组 （30.0mmol/L+2.5μg/mLADPN的DMEM培养液），以备MTT用。剩余细胞换为无血清DMEM培养液使细胞同步化生长24h后，将其分为正常对照组（5.5mmol/L葡萄糖的DMEM培养液）、高糖组（30.0mmol/L葡萄糖的DMEM培养液）、脂联素组 （30.0mmol/L+2.5μg/mLADPN的DMEM培养液），用于实时定量PCR。

1.3 MTT法测HCM增殖

每组设4个复孔，同时设调零孔，进行培养，为排除营养成分消耗对试验结果产生误差于48h更换培养液一次。培养24、48、72h后进行MTT检测，每孔加入5mg/mL的MTT20μL，继续孵育4h，吸取上清，每孔加入二甲基亚枫（DMSO）150μl，振荡10min，于酶标仪490nm处测吸光度（OD值）。

1.4 实时定量PCR

①RNA提取：弃上清，加入Trizol试剂提取各组RNA。②逆转录：反应体系总体积为20μL，按照逆转录说明合成cDNA。③实时荧光定量PCR测定：PCR反应总体积为50μL，PE7700PCR扩增仪上以其94℃预变性2min，94℃变性25s， 60℃退火30s，40个循环结束。由PCR反应曲线得到Ct值，通过2-△△Ct方法计算相对定量数值。

1.5 统计分析

2 结 果

2.1 细胞增殖

24、48、72h高糖组与正常对照组比较细胞增殖受抑制（P＜0.05）。在加入脂联素后24、48、72h脂联素组与高糖组比较细胞增殖增加，随时间的延长细胞增殖增加明显，有统计学差异（P＜0.05），见表1。

表1 脂联素对高糖环境下HCM增殖的影响(OD值)(±s)(n=3 )

表1 脂联素对高糖环境下HCM增殖的影响(OD值)(±s)(n=3 )

组别 24h 48h 96h对照组 0.4426±0.0516 0.5710±0.0356 0.7663±0.0076高糖组 0.3337±0.0265*0.2447±0.0040*0.1197±0.0133*高糖+脂联素组 0.5233±0.0119#0.7170±0.0061#0.9747±0.0369#

2.2 VEGF表达的结果

24、48、72h高糖组与正常对照组比较VEGFmRNA表达均增加，随着时间的延长表达逐渐增加（P＜0.05）。24、48、72h脂联素组与高糖组比较VEGFmRNA表达均明显下降，且呈时间依赖性（P＜0.05），见表2。

表2 脂联素对高糖环境下VEGFmRNA表达的影响(2-△△Ct值) (n=3)

3 讨 论

糖尿病性心肌病是一种特异性的心肌病，是糖尿病的严重慢性并发症之一，其典型病理改变为心肌细胞肥大，心肌间质增生及纤维化、心肌局灶性坏死、心肌血管壁增厚等。Braunwald等[3]认为糖尿病心肌病的可能原因包括胶原和终末糖基化产物修饰的细胞外基质蛋白积聚，导致心肌的顺应性和舒张功能受损，心肌钙调控异常，蛋白激酶-C（PKC）的激活，心脏自主神经功能紊乱，基因突变等。病程早期以心脏舒张功能异常为主，后期收缩功能也受损，出现心力衰竭的临床表现。其中，心肌细胞功能受损是糖尿病心肌病发生、发展的关键。

VEGF 是一种糖蛋白，由2个分子量为17～22kD相同亚基经过二硫键连接形成分子量为34～45kD 的同源二聚体。在多个组织、细胞中参与了纤维化的过程。在生理条件下，VEGF表达量很低，以维持机体内正常的血管生长、保持血管密度的生理稳定。缺血、缺氧、糖基化终未产物、血管紧张素Ⅱ等是刺激VEGF分泌的重要因素[4]。Way等[5]发现糖尿病大鼠心肌同工酶PKC活性增加，过度表达PKC-β2的PKC-β2转基因大鼠表现出心肌病和心肌纤维化。随纤维化的发展，特征性表现为结缔组织生长因子（CTGF）和转化生长因子β（TGF-β）的表达增加，Ⅳ型胶原和纤维结合素mRNA表达增加，CTGF单独或与其他细胞因子一起诱导心肌纤维化。

本研究结果显示，高糖环境下心肌细胞的增殖受到抑制，VEGF表达增加。可能是由于高糖通过葡萄糖依赖性通路选择性激活PKC，尤其是PKC-β1从而引起细胞信号传导异常而引起细胞凋亡和纤维化。Min等[6]通过对NF-кB途径抑制检测新生大白鼠心肌细胞中PKC/NF-кB/TNF-а、c-fos表达，认为高血糖可以通过PKC/NF-кB/TNF-а、c-fos信号转导途径引起心肌细胞肥大。高糖还可激活p38MAKP，直接底物磷酸化AP-1、c-myc、c-jun等，调节基因表达[7]，促进VEGF的增加和分泌。高糖致炎症反应细胞分泌大量细胞因子，如VEGF、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）等，国外多项研究[8,9]一致认为VEGF增多导致心肌细胞肥大。

ADPN是近年发现的一种由白色脂肪组织分泌的蛋白产物，由位于3q27的apM1基因编码，相对分子质量约3×104，具有244个氨基酸残基。正常情况下，ADPN的血浆浓度为5～30μg/mL，约占总血浆蛋白量的0.01%。其是一种具有对糖尿病保护作用的蛋白质，多项研究证明其具有抗炎、抗纤维化、抗动脉粥样硬化等多种作用。国外实验研究，Yajing[10]等对雄性小鼠心肌细胞经脂联素干预后也发现细胞死亡减少，起到对糖尿病心肌保护作用。对多种细胞研究显示[11]：在活体内ADPN下调Bcl-2 基因的表达，同时也可能抑制NF-Kb以及上调VEGF的转录因子的激活。但目前对糖尿病心肌病研究较少，尤其脂联素对心肌细胞保护的机制尚不清楚，本实验结果示加入脂联素后阻断了高糖对心肌细胞的损害，HCM增殖能力增加，VEGF表达明显降低，并呈时间依赖性，提示脂联素可能通过抗炎、抗纤维化作用直接或间接起到保护心肌细胞的作用，为临床应用脂联素治疗糖尿病心肌病提供了理论依据。

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