p16、ki-67在宫颈鳞癌及宫颈上皮内瘤变组织中的表达及临床意义

田 琦 孟 刚 (吉林省肿瘤医院，吉林 长春 130012)

宫颈癌的形成和演变是一个多因素、多基因共同参与的复杂而漫长的过程，经历宫颈上皮增生鳞化、宫颈上皮内瘤变(CIN)、宫颈浸润癌等不同阶段。p16、ki-67作为癌基因，直接作用于细胞周期，参与细胞增殖与分裂，促进肿瘤生成。本文应用免疫组化S-P法，观察p16、ki-67在宫颈鳞癌及CIN中的表达，旨在探讨二者在宫颈癌发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 标本均来自2009年10月至2010年12月本院病理科存档资料，其中宫颈鳞癌38例，年龄26～75(平均42)岁，术前未接受过其他治疗，CIN标本96例，其中CINⅠ、Ⅱ和Ⅲ分别为28、32和36例，年龄28～65(平均45)岁，收集因子宫肌瘤行子宫手术的正常宫颈组织14例作为对照。

1.2 主要试剂 兔抗人p16多克隆抗体购自福州迈新生物技术有限公司，ki-67为ZM-0166单抗，工作液由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。

1.3 免疫组化染色及结果判定 全部标本均经10%甲醛固定，常规石蜡包埋后连续切片，每例标本行HE染色及S-P免疫组化染色，光镜观察。免疫组化步骤按照S-P试剂盒说明书进行，一抗浓度为1∶100，由福州迈新技术有限公司及北京中杉金桥技术有限公司提供的阳性对照片作阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。p16阳性判定标准:p16阳性表达定位于细胞核和细胞质，呈淡黄色、棕黄色或棕褐色颗粒为阳性信号，每例随机观察5个高倍视野，用半定量积分判断结果:阳性细胞≤5%为0分，6% ～25%为1分，26% ～50%为2分，51% ～75%为3分，＞75%为4分，阳性强度黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分，两项积分相乘，0分为阴性(－)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为中度阳性()，9～12分为强阳性()。ki-67阳性判定标准:ki-67阳性表达于细胞核，呈棕黄色颗粒，或细胞核、细胞质同时呈棕黄色，于40倍光镜下计数100个细胞，每例标本计数1 000个细胞，ki-67指数=阳性细胞数总和/1 000×100%。

1.4 统计学方法 采用χ2检验、t检验及相关分析。

2 结果

2.1 宫颈鳞癌、CIN及正常宫颈组织中p16表达 p16在CIN、宫颈鳞癌组织中有丰富表达，阳性表达定位于细胞核和细胞质，在正常宫颈组织中不表达。p16表达的阳性程度:宫颈鳞癌接近于CINⅢ高于 CINⅠ、Ⅱ(χ2=6.24，P＜0.05)，CIN 中p16表达率为63.54%，随CIN级别的升高而提高，CINⅢ高于CINⅡ(χ2=4.23，P ＜0.05)，CINⅡ高于 CINⅠ(χ2=4.56，P ＜0.05)，正常宫颈组织与CINⅠ间及CINⅢ与宫颈鳞癌间差异不显著(P＞0.05)。见表1。

表1 CIN、宫颈鳞癌及正常宫颈组织中p16表达

2.2 CIN、宫颈鳞癌及正常宫颈组织中ki-67指数 ki-67阳性表达于细胞核，呈棕黄色颗粒，在宫颈鳞癌及CIN中有较丰富的表达，在正常宫颈组织中为弱阳性表达。ki-67指数:宫颈鳞癌(67.82±15.31)高于 CINⅠ、Ⅱ(t=6.18，P＜0.05)，CIN(40.36±11.12)高于正常宫颈组织(2.83±4.56)(t=5.36，P＜0.05)，CINⅢ(60.81±14.32)高于 CINⅡ(29.65±12.58)(t=6.58，P ＜0.05)，CINⅡ高于 CINⅠ(21.42±10.82)(t=2.15，P＜0.05)，宫颈鳞癌、各期别CIN的ki-67指数较正常宫颈明显增加(P＜0.05)。

2.3 宫颈鳞癌及各期别CIN中p16的表达强度与ki-67指数间呈正相关(P1＜0.05，r1=0.92;P2＜0.05，r2=0.96)。

3 讨论

CIN是宫颈癌癌前病变，寻找并发现宫颈癌发生、发展过程中相关的敏感指标，对阻断癌前病变的发展，减少宫颈癌的发生，帮助临床工作中早期诊断、早期治疗，判断其转归，都有着重要的指导意义。

p16基因定位于人第9号染色体短臂2区1带(9P21)，由3个外显子和2个内含子组成，为周期蛋白依赖激酶抑制剂，是直接参与细胞周期调控的抑制基因，其蛋白产物p16蛋白为细胞周期蛋白D/CDK激酶抑制因子，通过与细胞周期蛋白D(cyclin D1)竞争性结合CDK4/CDK6，特异性抑制CDK4、CDK6的消化活性，从而抑制视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)磷酸化和转录调节因子E2F的释放，形成对CDK4-cyclinD1-Rb-E2F的负反馈调节，阻断细胞由G1期至S期的增殖，引起细胞周期调节紊乱，导致细胞癌变〔1～3〕。Salit〔4〕等在研究高危 HPV 感染宫颈鳞癌和p16表达的关系中发现，p16与HPV16/18表达呈正相关，提示p16的过度表达是继高危HPV感染之后发生的。

本研究中发现，p16蛋白在正常宫颈组织中不表达，在宫颈癌癌前病变CIN中，随着CIN级别增加，表达逐渐增强，在宫颈癌中过度表达，说明p16在正常宫颈至CIN，直至最终发展为宫颈癌的过程中，呈现一个渐进表达过程，与肿瘤细胞生长失控有密切的关系，这在其他相关研究中也得到证实。

ki-67抗原是一种反映细胞增殖期的核抗原基因，是细胞增殖活性的指标，定位于人第10号染色体，在维持细胞增殖活性中起着重要作用，ki-67抗原在G0期缺失，在G1、S、G2/M期均有合成，准确反映细胞的增殖活性，对预测癌前病变向恶性病变转化有重要的参考价值，对恶性肿瘤的早期诊断、早期治疗有指导意义〔5，6〕。

本研究结果显示，正常宫颈组织、CIN和宫颈癌组织中的ki-67阳性表达有显著差异，表明宫颈癌的发生、发展与细胞增殖有密切关系。本研究结果还显示，宫颈癌及CIN中p16的表达强度与ki-67指数间呈现正相关，通过加快细胞增殖的作用，促进宫颈癌的发生、发展。

1 Khoo CM，Carrasco DR，Bosenberg MW，et al.Ink4a/Arf tumor suppressor does not modulate the degenerative conditions or tumor spectrum of the telomerase-deficient mouse〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2007;104(10):3931-6.

2 Eleuterio J Jr，Giraldo PC，Goncalves AK，et al.Prognostic markers of high-grade squamous intraepithelial lesions:the role of p16INK4a and high-risk human papillomavirus〔J〕.Acta Obstet Gynecol Scand，2007;86(1):94.

3 Cunningham LL Jr，Pagano GM，Li M，et al.Overexpression of p16INK4 is a reliable marker of human papillomavirus induced oral high-grade squamous dysplasia〔J〕.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2006;102(1):77-81.

4 Salit IE，Tinmouth J，Chong S，et al.Screening for HIV-associated anal cancer.correlation of HPV genotypes，P16，and E6 transcripts with anal pathology〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2009;18(7):1986-92.

5 余 俐，彭杰青，陈尚武.宫颈上皮内瘤变中P16INK4A和Ki-67的表达〔J〕.临床与实验病理学杂志，2007;23(6):665.

6 顾依群，高子芳，汪颖南，等.P16INK4A、P53、Ki-67及ER在宫颈病变中表达的临床病理学意义〔J〕.诊断病理学杂志，2008;15(2):131.