藻蓝蛋白对2型糖尿病大鼠血糖的调节作用

李继发 王世金 郭恒照 (济宁市任城区兖矿集团第三医院，山东 济宁 707)

2型糖尿病是一种自然免疫和低度炎症性疾病，细胞因子是导致代谢综合征的主要原因，而炎症是胰岛素抵抗的触发因素〔1〕。甚至在亚临床阶段，慢性炎症就参与了胰岛素抵抗综合征的发生〔2〕。在整个炎症网络中，核因子 κB(NF-κB)是研究的热点之一。NF-κB抑制蛋白(I-κB)激酶/NF-κB炎症通路活化是导致胰岛素抵抗和糖尿病的重要机制之一〔3〕。张冬梅等〔4〕研究表明，藻蓝蛋白在脑缺血损伤中具有抗炎和神经保护作用，但其在2型糖尿病病理生理过程中是否具有抗炎作用尚未见报道。为此，本实验建立2型糖尿病大鼠，试图应用藻蓝蛋白进行干预，研究其对胰岛细胞功能的影响和机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型 健康雄性Wistar大鼠30只，体重120～140 g，由青岛市药检所实验动物中心提供〔SCXK(鲁)20030010〕。动物均于实验前置于实验室适应环境1 w，自由饮食，室温(23±2)℃，自然光照，相对湿度50% ～70%。随机分为对照组、模型组和治疗组各10只。对照组10只大鼠喂以普通饲料，其余2组均喂以高糖高脂饲料(15%猪油、20%蔗糖、13%蛋黄粉、2%胆酸钠、59%普通饲料)，饲养4 w后禁食12 h，以30 mg/kg的剂量一次性腹腔注射1%链脲佐菌素(STZ)柠檬酸缓冲液，对照组大鼠同步注射同剂量的柠檬酸缓冲液。注射4 w后分别剪尾取血，测空腹血糖(FBG)，以血糖值≥7.0 mmol/L视为糖尿病模型建立成功〔5〕，其中16只造模成功。

1.2 干预措施 糖尿病模型成功后开始干预治疗。藻蓝蛋白粉剂(中国科学院海洋研究所提供)暗室分装后－20℃保存，加蒸馏水稀释至浓度为10%的混悬液，按500 mg/kg体重灌胃，每天1次，连续10 d。对照组和病模型组同步给予等体积的生理盐水，连续灌胃10 d。

1.3 FBG测定 各组动物分别在造模前、造模后、治疗后测定FBG(mmol/L)。测前，大鼠禁食、禁水12 h，次日鼠尾静脉取血，用自动血糖仪(强生医疗器材有限公司，稳豪型)测定FBG。

1.4 标本采集及处理 治疗结束后，各组大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛心脏灌注固定，取胰腺组织，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，LEICA2135石蜡切片机连续切片，厚度5 μm，每隔10片取1片，每个标本取6片，分别裱于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，室温保存备用。

1.5 细胞凋亡检测 TUNEL试剂盒由武汉博士德生物公司提供。取上述切片置于60℃烤箱1 h，常规脱蜡，蒸馏水浸泡2 min，按试剂盒说明书操作，DAB显色，光镜下细胞核出现片状棕黄色颗粒者为阳性着色，即凋亡细胞。部分切片不加探针，以0.1 mol/L PBS替代染色，不出现阳性着色。在光镜(400倍)下观察，每张切片随机选取4个视野，计数每个视野100个胰岛细胞中凋亡细胞所占的百分比的均数即为凋亡指数(AI)。

1.6 免疫组化染色 NF-κB p65和I-κB亲和纯化抗体、即用型SABC试剂盒、DAB显色试剂盒，均由武汉博士德生物公司提供。取上述切片置于60℃烤箱烤片1 h，常规脱蜡，蒸馏水浸泡2 min，严格按试剂盒说明书操作，DAB显色，光镜下特异性染色为棕黄色粗颗粒。部分切片不加一抗以0.1 mol/L PBS替代染色，不出现阳性着色。在光镜(400倍)下观察，每张切片随即选择4个视野，计数每个视野内胰岛细胞团中NF-κB和I-κB的阳性细胞数及胰岛细胞的总数。

1.7 统计学处理 采用SPSS11.5软件，计量资料结果以表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 FBG 造模前各组大鼠FBG无统计学差异，造模后大鼠FBG较对照组明显升高(P＜0.05)。经藻蓝蛋白治疗后，大鼠FBG较模型组显著下降(P＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠FBG比较(，mmol/L)

表1 各组大鼠FBG比较(，mmol/L)

与对照组比较:1)P＜0.05;与模型组比较:2)P＜0.05

造模前 造模后 治疗后对照组组别 n 10 3.28±0.43 3.48±0.50 3.91±0.71模型组 8 3.33±0.23 9.15±1.201) 8.94±0.901)治疗组 8 3.15±0.31 9.75±1.251) 7.05±0.871)2)

2.2 胰岛细胞凋亡 对照组大鼠胰岛可见少量散在的凋亡阳性细胞，模型组大鼠胰岛边界模糊，阳性细胞较对照组明显增多(P＜0.05)，治疗组大鼠胰岛边界较清晰，凋亡阳性细胞较模型组显著减少(P＜0.05)。见表2和图1。

表2 各组大鼠胰岛细胞AI、NF-κB和I-κB表达的比较()

表2 各组大鼠胰岛细胞AI、NF-κB和I-κB表达的比较()

与对照组比较:1)P＜0.05;与模型组比较:2)P＜0.05

组别 n AI(%) NF-κB(%) I-κB(%)10 6.00±1.63 15.7±1.83 78.5±2.55模型组 8 20.75±2.501) 38.3±3.811) 31.2±4.801)治疗组 8 12.25±2.221)2) 20.6±3.201)2) 58.0±5.261)2)对照组

2.3 NF-κB和I-κB表达 对照组大鼠胰岛细胞质NF-κB表达较强，显棕黄色。糖尿病模型组大鼠胰岛细胞核NF-κB表达显著增强，细胞核呈明显棕黄色着色，细胞质几乎不着色。藻蓝蛋白治疗组大鼠胰岛细胞核NF-κB表达较模型组明显降低，细胞核呈淡黄色(图2和表2)。对照组大鼠胰岛细胞质呈深棕黄色着色，细胞核几乎不着色。糖尿病模型组大鼠胰岛细胞核、质表达明显减弱。藻蓝蛋白治疗组大鼠胰岛细胞质有棕黄色着色，较糖尿病组加深(图3和表2)。

图1 各组大鼠胰岛凋亡细胞数量比较(TUNEL，×400)

图2 各组大鼠胰岛细胞NF-κB的表达(SABC，×400)

图3 各组大鼠胰岛细胞I-κB的表达(SABC，×400)

3 讨论

研究表明，大鼠胰腺是STZ毒性损伤的靶器官，STZ可以通过一氧化氮和自由基等途径损伤胰岛β细胞诱发糖尿病〔6〕，而自由基是激活NF-κB的因素之一。由此推测，糖尿病大鼠胰腺中有I-κB/NF-κB通路的活化。本实验NF-κB免疫组化结果可见，正常组大鼠胰岛细胞团中胰岛细胞质呈明显棕黄色着色，只局部胰岛细胞核有着色，而糖尿病大鼠胰岛细胞团中胰岛细胞核呈明显棕黄色着色，细胞质几乎不着色。I-κB免疫组化结果显示，正常组大鼠胰岛细胞质呈深棕黄色着色，细胞核几乎不着色，而糖尿病组大鼠胰岛细胞核、质几乎都不着色。这正体现了I-κB被降解后，激活的NF-κB从细胞质到细胞核的转移过程。藻蓝蛋白干预组大鼠NF-κB的免疫组化结果可见，胰岛细胞核着淡棕黄色，着色程度较糖尿病组明显减轻。I-κB的免疫组化结果显示，蓝藻蛋白干预组大鼠胰岛细胞质有棕黄色着色，着色程度较糖尿病组加深。表明药物干预后I-κB的活性可能有所恢复，NF-κB在胰岛细胞核中的表达降低。这提示藻蓝蛋白可能具有抑制I-κB/NF-κB通路活化的作用。

长期高血糖使胰岛素需求不断增加，β细胞处于持续活化状态，一方面削弱胰岛β细胞合成和分泌胰岛素的功能，使葡萄糖刺激的胰岛素分泌减少，甚至缺失;另一方面，长期高血糖加速β细胞凋亡，使有功能的β细胞数量减少，两者共同作用加重了胰岛β细胞功能的衰竭。导致β细胞凋亡的因素很多，例如胰淀素、葡萄糖、游离脂肪酸、细胞因子、一氧化氮、活性氧簇等〔7〕。沙鼠实验发现随着血糖的增高，β细胞的凋亡频率逐步上升〔8〕。本实验结果显示，造模成功后，大鼠 FBG显著升高，胰岛凋亡细胞是明显增多，经藻蓝蛋白治疗后，大鼠FBG较模型组显著下降、胰岛细胞凋亡数量明显减少。推测藻蓝蛋白可能作用于胰岛β细胞，保护胰岛β细胞，减少其凋亡，但其具体机制有待进一步研究。

1 Dandona P，Aljada A，Bandyopadhyay A.Inflammation:the link between insulin resistance，obesity and diabetes〔J〕.Trends Immunol，2004;25(1):4-7.

2 Festa A，D'Agostino R Jr，Howard G，et al.Chronic subclinical inflammation as part of the insulin resistance syndrome:the Insulin Resistance Atherosclerosis Study(IRAS)〔J〕.Circulation，2002;102(1):42-7.

3 Blaak EE.Fatty acid metabolism in obesity and type 2 diabetes mellitus〔J〕.Proc Nutr Soc，2003;62(6):753-60.

4 张冬梅，刘吉东，陈红兵，等.藻蓝蛋白对脑缺血再灌注后NF-κB和IL-6表达及神经细胞凋亡的影响〔J〕.中国海洋药物，2005;24(1):6-10.

5 郭啸华，志 红，李 恒，等.高糖高脂饮食诱导的2型糖尿病大鼠模型及其肾病特点〔J〕.中国糖尿病杂志，2002;10(2):290-2.

6 Takasa N，Komiya I，Asawa T，et al.Streptozotocin and alloxan-induced H2O2generation and DNA fragmentation in pancreatic islets.H2O2as mediator for DNA fragmentation〔J〕.Diabetes，1991;40:1141-5.

7 Mandrup-Poulsen T.Apoptotic signal transduction pathways in diabetes〔J〕.Biochem Pharmacol，2003;66:1433-9.

8 Donath MY，Gross DJ，Cerasi E，et al.Hyperglycemia-induced beta-cell apoptosis in pancreatic islets of Psammomys obesus during development of diabetes〔J〕.Diabetes，1999;48:738-46.