参芎化瘀胶囊对大鼠全脑缺血损伤的保护作用

李建民 赵雅宁 张姗姗 陈长香 马素慧 李淑杏 (华北煤炭医学院，河北 唐山 063000)

如果β淀粉样肽(Aβ)表达增加，作用时间延长，就会产生氧化应激损伤、炎症反应、损伤胆碱能神经系统、诱导神经细胞凋亡等神经毒性作用〔1，2〕。参芎化瘀胶囊是由人参、地鳖虫、川芎、乳香(制)、没药(制)、全蝎、紫河车、龙血竭、五味子、石菖蒲、郁金、桑葚子等多种成分组成的复方制剂，具有养血益气、化瘀通络等作用。以往研究表明川芎和郁金提纯的单方生物制剂对脑缺血损伤有一定的治疗作用〔3，4〕。本研究在大鼠全脑缺血再灌注损伤模型上，应用不同剂量参芎化瘀胶囊进行干预，观察其对神经功能及Aβ的影响，以探讨复方制剂参芎化瘀胶囊对缺血性脑卒中的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验药物 参芎化瘀胶囊主要由人参、地鳖虫、川芎、乳香(制)、没药(制)、全蝎、紫河车、龙血竭、五味子、石菖蒲、郁金、桑椹子等多种中药成分组成的复方制剂，由华北煤炭医学院研制，批号:Z20051586。

1.2 动物 雄性SD大鼠40只，购自中国医学科学院实验动物研究所，实验动物使用许可证编号:SCXK(京)2005-0013，体重(270±25)g。随机分成假手术组，模型组，参芎化瘀胶囊高，低剂量组，每组10只大鼠。

1.3 仪器、试剂 图像采集及图像分析系统(美国Bio-Rad生物仪器设备公司);八臂迷宫(淮北正华);Aβ兔多抗(北京中杉金桥生物技术有限公司);TUNEL试剂盒(Santa Cruz公司)。

1.4 方法

1.4.1 模型制作 采用改良的Pulsineli 4血管阻断(4-VO)法〔5〕制作SD大鼠全脑缺血模型。动物常规麻醉，颈正中切口，分离双侧颈总动脉，在其下置线备用。枕后部正中切开，暴露双侧第1颈椎横突翼孔，直视下热凝其下通过的椎动脉，电凝每次时间约2～4 s，使翼小孔后双侧椎动脉永久闭塞。术后大鼠缝皮回笼，24 h后以无创性微动脉夹夹闭双侧颈总动脉，缺血30 min后松开动脉夹，实行再灌注。缺血及再灌注期间用红外线测温仪监测耳内鼓膜温度，并使之维持在(37±0.2)℃。假手术组分离暴露血管，但不电凝椎动脉、不夹闭颈总动脉。参芎化瘀胶囊于术前7 d每日经胃灌注给药给药1次(低剂量2.4 g/kg，高剂量4.8 g/kg)，连续给药7 d，第7天常规麻醉后制作脑缺血再灌注模型，术后继续给药2 d。

1.4.2 Aβ免疫组织化学检测 标本多聚甲醛固定，经过脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，按试剂盒说明进行Aβ免疫组化染色(SABC法)。DAB显色，苏木精复染。利用多媒体彩色病理分析系统计值，取均值。

1.4.3 TUNEL法 标本多聚甲醛固定，经过脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，按TUNEL检测试剂盒进行操作，DAB显色，苏木精复染。阳性率的定量分析:每个标本取4张切片，每张切片在海马随机选取4个视野，在200倍光镜下计数阳性细胞。

1.4.4 学习和记忆功能检测 应用八臂迷宫学习和记忆行为功能检测，每只动物上下午各测试3次，每次间隔至少30 min，取均值。将大鼠放入迷宫内，记数大鼠5 min内搜索放置在八臂中的四个臂内(1、3、5、7号臂)食物饵的规律:①总错误次数，即沙鼠进入没有饵的臂(包括已吃完和未放饵的臂)的次数;②工作记忆错误次数，指沙鼠再次进入开始放有饵的臂;③参考记忆错误次数，指沙鼠第1次进入没有放饵的臂。

1.5 统计学处理 应用SPSS13.0统计分析软件，数据以表示，进行方差分析。

2 结果

2.1 Aβ免疫组织化学结果 Aβ阳性染色显棕黄色。假手术组，可见少量Aβ阳性细胞，染色浅淡;与假手术组比较，模型组中，Aβ阳性细胞增多，染色棕黄(P＜0.05);与模型组比较，参芎化瘀胶囊组Aβ性细胞数目明显增多，染色更加深;且高剂量组更加明显(P＜0.05)，见图1、表1。

2.2 海马区神经细胞凋亡变化 与假手术组比较，模型组中TUNEL阳性细胞显著增多(P＜0.05);与模型组比参芎化瘀胶囊组中TUNEL阳性细胞减少，高剂量组中更为明显(P＜0.05)，见图 2、表 1。

图1 各组大鼠海马区Aβ蛋白表达(DAB，×400)

图2 各组大鼠海马区凋亡神经细胞(TUNEL，×400)

表1 各组海马区Aβ表达、凋亡神经细胞数量(，n=10)

表1 各组海马区Aβ表达、凋亡神经细胞数量(，n=10)

与假手术组比较:1)P＜0.05;与模型组比较 :2)P＜0.05;与低剂量组比较:3)P＜0.05，下表同

18.52±2.21 3.17±2.00模型组 34.38±3.121) 33.45±3.481)低剂量参芎化瘀胶囊组 29.07±2.971)2) 22.58±2.271)2)高剂量参芎化瘀胶囊组 22.85±2.861)3) 17.47±1.841)3)凋亡神经细胞假手术组组别 Aβ

2.3 学习记忆功能评估 与假手术组比，模型组动物连续6测试中总错误次数、未进入食物所在臂的错误次数和重复进入食物所在臂的错误次数总均增加(均P＜0.05)，与模型组比较，参芎化瘀胶囊能显著减少总错误次数和参考记忆错误次数(P＜0.05)，但对工作记忆错误次数没有影响(均P＞0.05)，见表2。

表2 各组大鼠八臂迷宫测试结果(，n=10)

表2 各组大鼠八臂迷宫测试结果(，n=10)

工作记忆2.54±1.09 2.63±1.01 1.17±0.47模型组 8.84±3.781) 6.28±2.821)3.58±1.261)低剂量参芎化瘀胶囊组5.45±2.541)2)4.28±1.601)2)3.49±1.33高剂量参芎化瘀胶囊组3.12±1.801)3)2.10±1.001)3)错误次数假手术组组别 总错误次数 参考记忆错误次数3.35±1.58

3 讨论

神经细胞凋亡是造成缺血性脑卒中神经功能缺失的关键因素之一，抑制或减少伤后神经细胞的凋亡已成为缺血性脑卒中救治的关键环节。前期研究显示，对前脑缺血再灌注沙鼠进行缺血预处理，可抑制海马区神经细胞凋亡，改善动物的认知功能情况〔6〕。王征等〔7〕报道含有三七、当归、丹参、银杏叶等成分的脑脉泰可抑制缺血半暗带区神经细胞凋亡而发挥对脑缺血/再灌注损伤有保护作用。本研究结果说明参芎化瘀胶囊对缺血性脑卒中起到了良好的治疗效果。

研究表明缺血损伤后细胞毒性物质增多，使轴浆运输失衡，导致APP积聚或突变，水解途径趋向淀粉样肤生成途径，致使Aβ在细胞内的异常增多增多Aβ主要表达在缺血梗死区周围和胆碱能丰富的区域如海马等脑功能重要区域，并与缺血面积与时程相关〔8，9〕;现已证Aβ具有介导氧化应激损伤、炎症反应、损伤胆碱能神经系统和神经突触、诱导神经细胞凋亡等神经毒性〔10〕。本研究结果显示芎化瘀胶囊是通过有效拮抗Aβ神经毒性作用而改善脑缺血再灌注损伤后神经功能恢复的。

1 Lacor PN，Bunie MC，Furlow PW，et al.A beta oligomer-induced aberrati ons in synapse composition，shape，and density provide a molecular basis for loss of connectivity in Alzheimer's disease〔J〕.Neurosci，2007;27(4):796-807.

2 张晓杰，董海影，孙玉荣，等.大鼠大脑海马注射β-淀粉样蛋白对caspase-3蛋白表达的影响及通络救脑口服液的干预作用〔J〕.中华中医药杂，2010;25(10):1678-81.

3 钟 瑜，张 众，杨国汗，等.川芎嗪对脑缺血再灌注损伤后细胞间黏附作用的影响〔J〕.中西医结合心脑血管病杂志，2003;1(5):257-8.

4 吴晓燕.人参总皂甙对大鼠缺血再灌注后神经元凋亡的保护及作用机制的研究〔J〕.神经疾病与精神卫生，2005;5(5):347-50.

5 徐叔云，卞如镰，陈 修.药理实验方法学〔M〕.北京:人民卫生出版社，2002:1065-6.

6 李建民，赵雅宁，陈长香，等.缺血预处理对沙鼠前脑缺血后学习记忆功能及 HSP70表达的影响〔J〕.第四军医大学学报，2009;30(18):1707-9.

7 王 征，方 芳，方云祥，等.脑脉泰对大鼠脑缺血再灌注后神经细胞凋亡和 Akt，bcl-2 Bax和caspase-3表达的影响〔J〕.国际神经病学神经外科学杂志，2009;36(4):303-7.

8 李泰东，陆国辉，崔云燕.缺血再灌注对大鼠海马神经元淀粉样蛋白及其蛋白前体表达的影响及人参皂甙Rg的干预〔J〕.中风与神经疾病杂志，2008;25(3):417-20.

9 Van Groen T，Puurunen K，Maki HM，et al.Transformation of diffuse betaamyloid precurs or protein and beta-amyloid deposites to plaques in the thalamus after transient occlusion of the middle cerebral artery in rats〔J〕.Stroke，2005;36(30):1551-6.

10 刘 芬，闫 荣.Aβ1-40对PC12细胞突触素表达的影响〔J〕.中风与神经疾病杂志，2010;27(9):815-8.