人源性老年痴呆单链噬菌体抗体库的构建

苏雪莹 赵振富 徐 杰 汪华侨 初国良

(佳木斯大学附属第一医院检验科，黑龙江 佳木斯 154002)

抗体库技术是利用基因工程技术，在细菌中构建人类或某种动物所有抗体基因的表达文库，用以筛选某种抗原的特异性抗体〔1〕。它克服了传统杂交瘤技术制备单克隆抗体遇到的难题，如融合效率不高、杂交瘤不稳定、抗体产量低等。人们已通过抗体库技术成功的筛到了肿瘤的特异性抗体或相关性抗体〔2〕。阿尔茨海默病(AD)是以β淀粉样蛋白(Aβ)过量产生并病理性沉积，引起记忆及认知能力进行性衰退为特征的一种神经退行性疾病。近期的研究表明，抗Aβ抗体，包括抗体的Fab片段及/或者单链可变区抗体片段在阻止和延迟AD病人病理改变中起重要的作用〔3～6〕。然而，鼠源性的抗体由于可以引起人体产生人抗鼠抗体(HAMA)，从而限制了其作为诊断和治疗药物在人体上的应用。而人源性单链抗体(scFv)库是制备人源化单克隆抗体(mAb)最有效的方法之一。有鉴于此，本实验利用临床确诊AD病人的外周血B淋巴细胞，利用噬菌体抗体库技术，首次构建了AD病人的单链可变区噬菌体抗体库，为进一步筛选AD相关抗原的人源性抗体奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 ①人外周血B淋巴细胞:来自于20例临床诊断明确的AD病人的200 ml外周血;②菌株及质粒:大肠杆菌XLIBlue为本室保存，质粒pDAN5为颜锡蕴教授(中科院生物物理研究所)馈赠，M13KO7辅助噬菌体为本室保存;③试剂:淋巴细胞分离液(上海华精生物高科技有限公司)，Trizol reagent(Gibco公司)，逆转录试剂盒(Takara公司)，ExTaq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶及限制性内切酶BssHⅡ、SalⅠ、XhoⅠ、NheⅠ、BstNⅠ(大连宝生物公司)，酶切DNA片段回收采用Omega Gel Extraction Kit，质粒小量提取采用Omega Plasmid Mini Kit。1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取及cDNA的合成 淋巴细胞分离液分离200 ml AD病人外周血淋巴细胞，尼龙毛柱法提取B淋巴细胞;Trizol试剂提取细胞总RNA，采用随机六引物逆转录合成cDNA。具体操作按说明书进行。

1.2.2 VH、VL基因片段的扩增 ①引物的设计:根据人免疫球蛋白家族的保守序列，即第一框架区(F1)和连接区(J区)设计引物，共30条，可以扩增出全部人抗体的可变区片段。②引物的保护序列:扩增VH基因片段5'端引物保护序列为:TATC-_CTCGAGCGGTACC(下划线处为 XhoⅠ酶切位点)，3'端为:GGCGGATGCGCTAGC(下划线处为NheⅠ 酶切位点);扩增VL基因片段5'端引物保护序列为:TAATGCGCGCATGCC(下划线处为BssHⅡ酶切位点)，3'端为:GGTCGACCCTCCGGAACG(下划线处为SalⅠ酶切位点)。③PCR扩增:由于引物数量较多，且都是简并引物，因此为方便扩增，将VH基因的4条3'端引物混合，与7条5'端引物分别扩增VH基因片段;将Vλ基因的2条3'端引物混合，与9条5'端引物分别扩增Vλ基因片段;将Vκ的4条3'端引物混合，与4条5'端引物分别扩增Vκ基因片段。以逆转录合成的cDNA为模板，反应条件:热启动94℃，5 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 45 s，共 30 个循环，最后72℃延伸10 min。

1.2.3 VL基因片段的纯化和克隆 PCR扩增出的抗体VH和VL基因片段上样，15 g/L琼脂糖电泳，紫外灯下切取凝胶上的目的条带，按Omega公司的Gel Extraction Kit说明书操作，进行纯化。纯化后的VL基因片段分别用BssHⅡ、SalⅠ双酶切，酶切后的片段凝胶纯化回收后，与同样双酶切并凝胶回收的pDAN5质粒以3∶1的比例，16℃反应16 h连接，连接完毕后70℃作用10 min灭活T4连接酶，电转化感受态大肠杆菌XLIBlue。转化后的细菌铺到含10 mg/L四环素、100 mg/L氨苄西林的LB琼脂板上，37℃过夜。次日，刮下全部阳性克隆，转移到200 ml含20 g/L葡萄糖、10 mg/L四环素、100 mg/L氨苄西林的LB培养基中过夜，提取重组质粒pDAN5-VL。

1.2.4 VH基因片段的纯化和克隆 纯化后的VH基因片段分别用XhoⅠ、NheⅠ双酶切，酶切后的片段凝胶纯化回收后，与同样双酶切并凝胶回收的pDAN5-VL质粒连接并转化感受态大肠杆菌XLI-Blue(同上VL基因片段的克隆)。

1.2.5 抗体库的构建 转化后的细菌铺板过夜培养，刮取全部阳性克隆，转移至含 20 g/L葡萄糖、10 mg/L四环素、100 mg/L氨苄西林的2YT培养基中培养至A600=0.5时，按20∶1的比例加入辅助噬菌体M13KO7超感染，感染后的细菌转移至含20 g/L葡萄糖、100 mg/L氨苄西林、50 mg/L卡那霉素的2YT培养基中30℃过夜培养，收集全部重组噬菌体，最终保存为初级单链噬菌体抗体库。

1.2.6 抗体库的鉴定 ①PCR鉴定:噬菌体感染对数期大肠杆菌XLI-Blue后，随机挑取10个阳性克隆，提取重组质粒pDAN5，以质粒为模板，利用特异性上、下游引物PCR扩增scFv目的条带，结果用15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测目的条带;②双酶切鉴定:以BssHⅡ和NheⅠ双酶切随机提取的10个阳性克隆pDAN5噬菌粒，结果用琼脂糖凝胶电泳检测;③抗体库多样性鉴定:取PCR扩增回收的scFv基因片段，BstNⅠ内切酶酶切并进行指纹图谱鉴定，结果用40 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果

2.1 总RNA的提取及cDNA的合成 从AD病人外周血共分离出2×108的B淋巴细胞，从中提取总RNA，稀释后紫外分光光度计测定其260 nm/280 nm=1.96，总RNA量为0.48 mg，可满足进一步合成cDNA的要求。逆转录反应分10管进行，反应结束后混合所有反应产物。

2.2 VH、VL基因片段的扩增 以合成的cDNA为模板，一半扩增 VH、一半扩增 VL，每50 μl反应体系取0.5 μl逆转录产物为模板进行PCR，所有逆转录产物全部扩增后，分别收集PCR产物，用15 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示扩增出所有VH、VL目的基因片段(7组VH基因和13组VL基因:4组Vκ，9组Vλ)，其大小约350 bp，与预期结果相符。见图1。

2.3 抗体库的鉴定

2.3.1 抗体库的PCR鉴定 从构建的抗体库中随机挑取10个克隆，以特异性引物扩增scFv目的片段，琼脂糖凝胶电泳检测显示10个克隆均扩增出明显的scFv目的条带，其大小约800 bp，与预期结果相符。见图2。

2.3.2 抗体库的酶切鉴定 以BssHⅡ和NheⅠ内切酶双酶切提取的10个阳性克隆的pDAN5噬菌粒，酶切后产物用15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示10个克隆均成功克隆入scFv目的片段，其大小约750 bp。见图3。

2.3.3 抗体库的多样性检测 取经PCR扩增、凝胶回收的scFv片段，BstNⅠ内切酶酶切(BstNⅠ的酶切位点随机分布于抗体可变区基因中)，40 g/L琼脂糖凝胶电泳进行指纹图谱鉴定，结果显示各克隆的scFv片段BstNⅠ消化后的指纹图谱各不相同，提示构建的噬菌体单链抗体库中每个克隆的scFv片段都不同。见图4。构建的抗体库经梯度稀释后，计算得出本实验构建的AD噬菌体抗体库的库容量是1.5×106。

图1 VH和VL基因片段的扩增

图2 抗体库的PCR检测

图3 抗体库的酶切检测

图4 不同克隆ScFv片段BstNⅠ消化后的指纹图谱

3 讨论

抗体库的多样性(指抗体库中含不重复克隆的数目)对随后筛选出高亲和力的抗体很重要，其多样性主要决定于两个因素:①B淋巴细胞数目:B细胞的数目是决定抗体库多样性的首要因素。一个B细胞含有一种抗体基因，欲构建大容量、高质量的抗体库，其抗体基因的来源必须保证有足够的多样性。人类天然抗体库的重链即有107的多样性，轻链基因有105，只有淋巴细胞的量达到这个数量级，才有可能将每一种抗体基因都扩增出来。本实验从20例AD患者的200 ml外周血中分离B淋巴细胞，经计数其数量达到2×108，这就为成功构建大库容量的抗体库提供了最初的保证;②引物的设计选择:在保证抗体基因来源的情况下，要尽可能扩增出全部抗体基因，避免某个或某些家族基因的丢失，引物的设计是关键。一般是用第一框架区(FR1)和第四框架区(FR4)保守序列为基础设计引物。不同的研究人员所采用的引物对于全套抗体的扩增效率是不同的，如Marks等的引物扩增效率是59.5%，Welschof等的引物扩增效率是62.8%。而1998年Bradbury报道的扩增人抗体可变区基因(VH和VL)的一组引物，经系列检测，证实其扩增效率为100%。本实验在引物的选择上，采用了Bradbury报道的引物组序列，并加上相应的酶切位点和保护性碱基。从PCR的结果可以看出，抗体每一个家族的成员都被成功地扩增了出来，证实本实验选用的引物其扩增效率为100%。

抗体对AD的治疗作用目前已成为学者们的共识，近来的研究证实，单克隆抗体的片段，如F(ab)2和scFv，同样可以有效抑制 Aβ 的聚集，阻碍 Aβ 诱导的神经毒性作用〔5，6，8〕。单链可变区抗体片段不含全抗体的Fc段，因此在结合AD相关蛋白，如Aβ肽时，不会启动补体级联反应，限制了炎症反应。同样，用单链抗体做被动免疫不会激活T细胞，也不会激活可以引起广泛炎症反应的小胶质细胞。此外，单链抗体与全抗体比较还有较低的分子量，使其更容易穿过血脑屏障入脑，因此单链可变区抗体片段对AD来讲，是一种具有很好发展前景的免疫治疗途径〔6〕。

尽管单链抗体存在着诸多的优点，使其具有广泛的应用前景，但也存在有自身的缺点，其中最主要的缺点就是亲和力较低，一般只能达到机体初级免疫时抗体的亲和力水平。对此问题的解决方法是构建大库容量的噬菌体抗体库，或者对筛选到的抗体进行体外的亲和力成熟。免疫抗体库由于抗体可变区基因均来源于经过某种抗原免疫的，已分化的浆细胞或者记忆性B细胞，其分泌的抗体在体内已经经历了亲和力成熟的过程，因此即使在库容量不大的情况下，也可以比较容易地筛选出高亲和力的抗体。Portolano等〔9〕报道从免疫抗体库中克隆的抗体亲和力达到10－9M水平，而库容量仅有2×106;而抗体库用没有免疫机体的其他抗原筛选时，其抗体亲和力降低十倍。这表明免疫抗体库对于筛选特定抗原的片段抗体是非常合适的。本实验利用20个AD病人外周血B细胞，首次构建了AD病人的噬菌体单链抗体库。由于AD病人外周血中Aβ肽等蛋白的滴度远高于正常人，其自身的抗体必然经历了一个亲和力成熟的过程，因此该抗体库可被认为是一个人源的“免疫”单链抗体库，而这些B细胞中必然包含多种多样的对AD相关蛋白有高特异性及亲和力的抗体基因。与天然抗体库和合成抗体库相比，免疫抗体库更容易筛选到接近自然状态的，具高特异性和亲和力的抗体〔10〕。因此，从本文构建的这样一个“免疫”噬菌体抗体库中，以特异的AD相关蛋白为靶点，筛选出接近自然状态的中和Aβ的抗体是极具可行性的。

1 Hoogbenboom HR，De Bruine AP，Hufton SE，et al.Antibody phage display technology and its applications〔J〕.Immunotechnology，1998;4(1):1-20.

2 Liu F，Fang C，Ye X，et al.Anti-4-1BB scFv immunogene therapy and lowdose cyclophosphamide exhibit a synergistic antitumor effect in established murine lung tumors〔J〕.Cancer Biol Ther，2009;8(8):707-13.

3 Wilcock DM，DiCarlo G，Henderson D，et al.Intracranially administered anti-Abeta antibodies reduce beta-amyloid deposition by mechanisms both independent of and associated with microglial activation〔J〕.J Neurosci，2003;23:3745-51.

4 张 革，汪华侨，邹俊涛，等.Aβ多价DNA疫苗的构建及其对体液免疫的效果〔J〕.中山大学学报(医学科学版)，2005;26(4):371-6.

5 Zameer A，Kasturirangan S，Emadi S，et al.Anti-oligomeric Aβ singlechain variable domain antibody blocks Aβ-induced toxicity against human neuroblastoma cells〔J〕.J Mol Biol，2008;384(4):917-28.

6 Liu RT，Yuan B，Emadi S，et al.Single chain variable fragments against β-amyloid(Aβ)can inhibit aggregation and prevent Aβ-induced neurotoxicity〔J〕.Biochemistry，2004;43:6959-67.

7 Dasilva KA，Aubert I，McLaurin J.Vaccine development for Alzheimer's disease〔J〕.Curr Pharm Des，2006;12(33):4283-93.

9 Portolano S，Prummel MF，Rapoport B，et al.Molecular cloning and characterization of human thyroid peroxidase antoantibodies of lambda light chain type〔J〕.Mol Immunol，1995;32:1157.

10 Manoutcharian K，Acero G，Munguia ME，et al.Amyloid-beta peptidespecific single chain Fv antibodies isolated from an immune phage display library〔J〕.J Neuroimmunol，2003;145(1):12-7.