艾灸关元、足三里穴对不同月龄大鼠空间学习记忆能力的影响

王淑娟 王艳杰 石星业 宫 菲 赵 胤 (辽宁中医药大学针灸推拿学院，辽宁 沈阳 0032)

记忆能力减退是机体早期衰老的临床表现，也是脑老化的重要标志。Morris水迷宫是研究大鼠空间学习记忆能力的重要行为学方法。本实验运用Morris水迷宫方法，从空间学习记忆能力方面入手，观察保健灸法对不同月龄大鼠行为学的改善作用，为艾灸防治衰老提供科学的佐证。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 SD雌性大鼠70只，由北京维通利华有限公司提供，许可证号:SCXK(京2006-0009)青年对照组14只，3 月龄，体重190 ～250 g，10月龄28 只，体重350～450 g，随机分为2组，即10月龄灸治组及10月龄对照组。12龄28只，体重390～450 g，随机分为12月龄灸治组及12月龄对照组。各组动物在同等条件下常规喂养，实验室光照充足，通风良好，温度保持在(24±2)℃，湿度保持在40% ～60%。

1.2 实验方法 10月龄灸治组及12月龄灸治组动物每周灸关元、足三里4次，持续灸2个月，青年组及对照组每周相同时间同样抓取，但不灸，亦不让其闻到灸的味道。持续2个月。

1.3 灸治的部位和方法 大鼠关元、足三里穴定位，参照大鼠标准穴位图谱。关元位于大鼠两后肢根部连线的中点。足三里在大鼠膝关节后外侧，即胫骨粗隆下缘与腓骨小头下缘连线之中点处。灸前将穴区直径约1 cm左右的鼠毛剪干净，暴露穴区皮肤。自制艾炷:底盘直径0.7 cm，艾柱直径0.1 cm，重1.0 g，放置于带有小孔附双面胶的橡皮垫上，将橡皮垫粘贴在穴区，小孔对准穴位，点燃艾炷。灸后局部皮肤略红，无发泡。

1.4 定位航行实验〔1，2〕水槽分东、南、西、北四个象限(NE、SE、SW、NW)，实验前将大鼠背部栓一红绳做标记物(计算机对红色分辨率高)。实验开始2个月后，开始进行定位航行实验。

实验第一天，水槽中不放置平台，将大鼠放入水中180 s，自由游泳以适应环境。正式训练时，在水槽北象限放一平台，平台直径为10 cm，低于水面大约2 cm，迷宫上方安装有显示系统的摄像机，同步记录大鼠运动轨迹。

第二天开始训练，连续6 d，每天1次。训练时随机选择一个入水点，将大鼠面向水槽壁放入水中，记录大鼠找到平台的时间(逃避潜伏期)，每次计时120 s，若120 s未找到平台，便把大鼠放到平台上10 s让其熟悉，逃避潜伏期记录为120 s。连续训练第7天后正式测试。将大鼠背对平台投入水槽中，记录其寻找到平台的潜伏期，评价动物空间记忆的获得能力。实验全过程要求保持安静，水槽周围物品固定，作为动物的空间参照物。并应及时清除水槽内大鼠粪便，以免影响实验结果。

1.5 空间搜索实验 定位航行实验结束次日，撤出平台，在随意入水点将大鼠面向水槽壁放入水中，各组大鼠根据记忆寻找原平台所在象限，监测时间为120 s，由计算机自动跟踪并记录下大鼠游泳轨迹，并计算出大鼠跨越原平台的次数及在原平台所在象限停留时间。评价大鼠的空间记忆保持能力。

1.6 统计学处理 采用SPSS15.0软件包进行统计分析。计量资料以±s表示，组间均数比较用单因素方差分析。

2 结果

2.1 一般状况观察 10月龄对照组大鼠游泳速度较快，但运动轨迹大多为环形，在平台所在象限游动时间短，而10月龄灸治组大鼠游泳速度快与青年组相似，运动轨迹多为直线，在平台所在象限附近游动时间长，对面象限游动很少。12月龄对照组大鼠运动减少，反应迟缓，运动轨迹大多沿着池壁进行环绕且远离平台所在象限游动，12月龄灸治组大鼠游泳速度慢，运动轨迹大多沿着池壁进行环绕。

2.2 定位航行实验 各组大鼠在6 d的水迷宫定位航行训练中，寻找平台的平均逃避潜伏期有明显变化，随着训练次数的增加，各组潜伏期均有不同程度的缩短。各组在训练第4天后逃避潜伏期基本趋于平稳。训练后第7天各组大鼠逃避潜伏期时间见表1。大鼠逃避期代表认知能力，逃避潜伏期越短，学习能力越强。青年组平均逃避潜伏期的时间最短，12月龄对照组平均逃避潜伏期的时间最长，10月龄灸治组逃避潜伏期较对照组明显缩短(P＜0.05)。而12月龄灸治组逃避潜伏期与对照组相比较无显著性差异(P＞0.05)。

2.3 空间搜索实验 撤去平台后，观察各组大鼠的空间探索能力，即寻找原来平台所在象限，青年组的游泳轨迹基本集中在平台象限，高龄对照组大鼠的游泳轨迹集中趋势不明显，各组之间比较有显著差异(P＜0.05)。说明随着月龄的增加，大鼠的空间搜索记忆能力明显下降。10月龄灸治与对照组比较，通过平台的次数及在原平台象限时间比率，有显著差异。而12月龄灸治与对照组比较，通过平台的次数及在原平台象限时间比率，未见显著差异。说明灸法可以提高大鼠的空间搜索能力，但对于高龄的大鼠效果并不明显。各组大鼠通过平台的次数及在原平台象限停留时间见表1。

表1 各组大鼠学习记忆能力的检测(x ± s，n=14)

3 讨论

《素问·阴阳应象大论》载“年四十而阴气自半也，起居衰矣，年五十体重耳目不聪矣。”即人类从四十岁开始，体内阴精自耗过半，精力体力脑力开始呈现衰退趋势。本实验采用类似于人类年龄40岁(更年期前期)与50岁(更年期)相近似的10月龄及12月龄雌性自然老化大鼠为研究对象〔3，4〕。观察评价保健灸对不同月龄大鼠在Morris水迷宫中定位航行及空间搜索试验中的学习记忆能力的影响。以其探求预防衰老的最佳保健灸治时机。

无病而灸，又称“逆灸”、保健灸，是未老先灸。通过在具有保健功效作用的穴位上施灸，逐渐积累灸效，以达到防病保健的目的。关元，为任脉与足三阴经的交会穴。《针灸穴名解》中称此穴为“人身阴阳元气交关之处，为养生家聚气凝神之所”，联系命门真阳，为阴中之阳穴。艾灸关元穴可补摄下焦元气，扶助机体元阴元阳，延年益寿。《医学入门》载:“关元主诸虚损”。足三里，具有温补脾胃，益气养血，扶正培元的功效。《外台秘要》云“三里养后天之气，灸三里可使元气不衰”。两穴为保健灸法的常用穴，上下相配，共奏补肾健脾、益气活血、培元固本、延年益寿之功。

学习记忆是大脑的高级神经活动，是认知活动的组成部分，学习是接受外界环境的信息而影响自身行为的过程，记忆是对获得的信息在脑内进行储存、加工和提取的过程〔5〕，可分为记忆获得、记忆巩固和记忆再现。Morris水迷宫实验是20世纪80年代初建立起来的评估啮齿动物学习、记忆、空间定向及认知功能的可靠试验方法。主要包括定位航行试验和空间探索实验两部分。是检测大鼠在多次训练后，学会寻找固定位置隐蔽平台，形成稳定的空间位置认知的能力。大鼠与人类一样随着年龄的增长，会出现学习记忆能力的减退〔6〕，大鼠逃避潜伏期可反映大鼠寻找安全平台的空间认知能力，而大鼠在水迷宫中定位游泳寻找平台所在象限及在平台穿越的次数，可以反映大鼠的空间记忆能力。本实验结果客观地证实了艾灸关元、足三里穴可以提高不同月龄大鼠的学习及记忆能力，以10月龄大鼠表现尤为明显。提示灸法应提早进行。

1 韩太真，吴馥梅.学习与记忆的神经生物学〔M〕.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998:61.

2 张均田.现代药理实验方法学(上册)〔M〕.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998:1022.

3 刘宏艳，王 滨.电针对更年期大鼠神经内分泌免疫网络的影响〔J〕. 江苏中医药，2003;24(1):94-6.

4 俞 瑾，李超荆.更年春治疗更年期综合征的临床和药理研究〔J〕.生殖医学杂志，2000;9(5):266-71.

5 程 明，朱熊兆.学习记忆的行为学研究方法〔J〕.中国行为医学科学，2005;14(1):65-6.

6 王 蓉，唐 玉，叶翠飞，等.大鼠学习记忆功能随增龄变化的实验研究〔J〕. 中国行为医学科学，2006;15(3):200-1，210.