低氧对顺铂损伤A549细胞的影响

孔晓霞 李梦楠 朱雯婷 李 超 秦 臻 张 婷

(温州医学院低氧医学研究所 机能实验教学中心，浙江 温州 325035)

低氧(Hypoxia)是许多恶性疾病的重要病理生理特征之一，大约有90%的实质性肿瘤中都存在低氧现象。适度的低氧环境可激发机体一系列内在的适应性过程，不但可以维持细胞的正常功能，而且对抵抗机体损伤具有一定作用〔1〕。自噬(Autophagy)是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程〔2〕。在低氧或者营养缺乏时，细胞能够通过自噬方式获取ATP以及其他保证基本代谢过程的营养物质，从而拮抗损伤，对细胞生存具有保护作用〔3〕。但是，过度激活的自噬会引起程序性细胞死亡，导致细胞生存率下降，这种细胞死亡方式被定义为自噬型细胞死亡〔4〕。可见，自噬在细胞分化和增殖中的作用依然存在着广泛的争议。本研究通过探讨低氧条件对顺铂(DDP)抗肿瘤效应的影响及细胞自噬的作用，以进一步阐明低氧和肿瘤发生发展的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人非小细胞肺癌A549细胞株由温州医学院机能实验中心保存。

1.1.2 仪器与试剂 激光共聚焦显微镜(FV1000型，日本O-lympus)观察A549细胞荧光染色结果;酶标仪(美国Thermo公司)用于亚甲基四唑蓝(MTT)法检测细胞生存率。细胞培养用1640培养液以及新生牛血清购于美国Hyclone公司。DDP及免疫荧光染料(MDC)、荧光染料(Hoechst33342)均购于美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 A549细胞培养 A549细胞置于完全培养基(10%新生牛血清，1640培养液，pH7.4)中，37℃、5%CO2培养箱中培养。每2～3 d用0.25%胰酶消化后，换液传代培养用于后续实验。

1.2.2 MTT法测定细胞生存率 取对数生长期A549细胞，经消化制成细胞悬液，以每孔100 μl，1×104细胞数接种于96孔板，24 h后按实验分组加入 10 μmol/L DDP和 20 μmol/L DDP，分别放入常氧(20%O2)和低氧培养箱(1%O2)。在8 h后加入MTT(5 mg/ml)20 μl，继续培养4 h后吸出培养液，加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl，振荡 10 min，570 nm 测其吸光度值。实验重复3次。

1.2.3 MDC染色检测细胞自噬空泡变化 MDC是一种自噬空泡的标志物，可以通过MDC染色观察判断细胞自噬过程的发生。以4%预冷的多聚甲醛，4℃下固定15 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍，加入终浓度为50 μmol/L的 MDC染色液，37℃孵育60 min，PBS洗2遍。激光共聚焦显微镜下观察细胞自噬空泡的变化。

1.2.4 Hoechst33342染色检测细胞凋亡 取对数生长期A549细胞，经消化制成细胞悬液，以每孔5×104细胞数接种于24孔板中，细胞贴壁后，按照实验分组在药物处理后12 h，PBS洗2遍，弃上清，加入终浓度1 μg/ml的 Hoechst33342染色，37℃孵育15 min，PBS洗2遍，激光共聚焦显微镜观察细胞染色质凝集及形态变化。

1.3 统计学分析 应用SPSS13.0统计软件，数据以表示，多组间比较使用单因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 结果

2.1 常氧和低氧条件下DDP对A549细胞增殖率的影响 在常氧条件下，单独应用DDP作用于A549细胞12 h，细胞增殖率明显下降，并呈剂量依赖性;而在低氧条件下，DDP对A549细胞的损伤作用明显降低，细胞死亡率与常氧条件下的DDP组相比明显降低(P﹤0.05)。见图1。

图1 常氧和低氧条件下DDP对A549细胞增殖率的影响

2.2 MDC染色检测细胞自噬空泡变化 单独应用10 μmol/L DDP作用于A549细胞时，未见MDC荧光聚集现象，表明细胞内无明显自噬空泡堆积。单独的低氧条件下或低氧条件下应用DDP作用A549细胞12 h，细胞均出现大量自噬空泡积聚，表明有自噬过程发生，并有明显差异(P＜0.05)。见图2。

2.3 Hoechst33342染色检测细胞凋亡 单独应用DDP作用A549细胞12 h，细胞核碎裂，染色质凝聚明显，表明有显著细胞凋亡过程发生;在单纯低氧条件下，未见细胞核形态明显变化，无明显细胞凋亡发生。而低氧条件下，DDP作用A549细胞12 h，细胞染色质凝聚水平与常氧条件下DDP组相比显著下降(P﹤0.05)，细胞损伤程度明显降低。见图3。

图2 MDC染色检测常氧或低氧条件下DDP作用A549细胞自噬空泡的变化及平均荧光强度分析(×600)

图3 Hoechst33342染色检测常氧和低氧条件下DDP对A549凋亡细胞核染色质浓缩的影响及平均荧光强度(×400)

3 讨论

肺癌是目前全球癌症发病率和死亡率位居第一的恶性肿瘤，探讨其发生机制及有效的治疗手段一直是受到广泛关注的研究热点之一。在正常机体中，氧浓度的变化对组织细胞的代谢、增殖、分化具有重要的调节作用。为了适应低氧条件，肿瘤细胞通过激活一系列信号机制，例如血管生成、细胞新陈代谢增强、迁移等，促进了细胞增殖、转移、耐药等。不仅改变了肿瘤细胞的生物学特性，引起肿瘤细胞的遗传不稳定性及恶性选择，导致肿瘤发生恶性转化甚至转移。而且研究表明低氧也是肿瘤细胞对放疗、化疗产生抗性的主要原因之一〔5〕。因此，低氧作为抗肿瘤靶点的研究备受许多学者关注。已有研究表明自噬在饥饿、氧化应激、低氧等条件下对细胞具有一定程度的保护作用〔6〕。本研究提示肿瘤细胞的低氧环境可能通过某种机制降低了DDP的损伤作用。

低氧诱导因子1(HIF-1)是低氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种核转录因子，HIF-1α能够上调BNIP3(只具有BH3区的Bcl2家族成员)的表达引起自噬蛋白Beclin 1活性增强，诱导自噬的发生，达到保护细胞的作用〔7，8〕。本实验结果表明DDP作用A549细胞后，自噬水平变化不明显，但低氧条件则能够引起细胞发生自噬。常氧条件下应用DDP作用A549细胞，细胞核发生明显皱缩，染色质凝聚。但低氧条件下，DDP对细胞核的损伤作用则显著降低。这提示在低氧条件下，细胞自噬信号的激活，对于DDP诱导的细胞损伤可能起到了一种促增殖性的保护作用，进而降低了细胞死亡率。

以上结果表明，DDP能够引起A549细胞发生凋亡，在低氧条件下引起的自噬降低了DDP的损伤作用，其具体机制及涉及的信号通路还有待于进一步探讨。

1 Matsumoto S，Yasui H，Mitchell JB，et al.Imaging cycling tumor hypoxia〔J〕.Cancer Res，2010;70(24):10019-23.

2 Sato K，Tsuchihara K，Fujii S，et al.Autophagy is activated in colorectal cancer cells and contributes to the tolerance to nutrient deprivation〔J〕.Cancer Res，2007;67(20):9677-84.

3 Mizushima N，Levine B，Cuervo AM，et al.Autophagy fights disease through cellular self-digestion〔J〕.Nature，2008;451(7182):1069-75.

4 Abedin MJ，Wang D，McDonnell MA，et al.Autophagy delays apoptotic death in breast cancer cells following DNA damage〔J〕.Cell Death Differ，2007;14(3):500-10.

5 Degenhardt K，Mathew R，Beaudoin B，et al.Autophagy promotes tumor cell survival and restricts necrosis，inflammation，and tumorigenesis〔J〕.Cancer Cell，2006;10(1):51-64.

6 Cosse JP，Michiels C.Tumour hypoxia affects the responsiveness of cancer cells to chemotherapy and promotes cancer progression〔J〕.Anticancer Agents Med Chem，2008;8(7):790-7.

7 Azad MB，Chen Y，Henson ES，et al.Hypoxia induces autophagic cell death in apoptosis-competent cells through a mechanism involving BNIP3〔J〕.Autophagy，2008;4(2):195-204.

8 Zhang H，Bosch-Marce M，Shimoda LA，et al.Mitochondrial autophagy is an HIF-1-dependent adaptive metabolic response to hypoxia〔J〕.J Biol Chem，2008;283(16):10892-903.