吲哚美辛通过Akt/GSK3β/NAG－1信号通路诱导胃癌细胞的凋亡*

庞瑞萍， 胡品津， 曾志荣， 陈 为

(中山大学1中山医学院生理教研室，2第一附属医院消化内科，广东 广州 510080)

流行病学研究表明长期使用非甾体类消炎药(non －steroidal anti－ inflammatory drugs，NSAIDs)可预防结肠癌、食管癌、胃癌等肿瘤的发生［1，2］。许多临床前实验也证实此观点［3，4］。尽管目前NSAIDs在消化道肿瘤防治中的作用已被广泛认可，但其作用机制尚未完全阐明。传统观点认为NSAIDs是通过抑制环氧合酶(cyclooxygenase，COX)而发挥抑制肿瘤的作用，但越来越多的研究表明非COX依赖途径在其中也发挥了很重要的作用［5］。现已证实，除COX外，还有10多个靶点可介导NSAIDs的作用［6］，如核因子 κB(nuclear factor κB，NF － κB)、3 － 磷酸肌醇依赖性激酶1(3－phosphoinositide－dependent kinase 1，PDK1)/Akt、过氧化物酶体增殖子活化受体(peroxisome proliferator － activated receptor，PPAR)、NSAID活化基因(non－steroidal anti－inflammatory drug－activated gene，NAG－1)等。其中磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/Akt(phosphatidylinositol 3－kinase/protein kinase B/Akt，PI3K/PKB/Akt)通路既可调节细胞增殖和存活，又可以调节糖原合成，而这些都是肿瘤预防和治疗的重要靶点［7，8］。我们前期的研究发现COX抑制剂可抑制胃癌细胞的增殖，诱导胃癌细胞凋亡［9］;在体实验表明COX抑制剂可明显抑制大鼠胃腺癌的发生［10］。进一步研究我们发现，COX抑制剂的上述作用与COX－2的表达并无明显关系［9，11］。本研究从细胞学角度观察吲哚美辛对胃癌细胞株生长的作用，并在此基础上探讨了吲哚美辛的作用与Akt/GSK3β/NAG－1信号通路的关系。

材料和方法

1 材料和方法

1.1 细胞培养 胃癌细胞株MGC－803由中科院上海细胞所赠送。细胞用含10%新生小牛血清(Hyclone)的DMEM培养基(Gibco)于37℃、5%CO2的培养箱内培养。以0.125%胰蛋白酶+0.020%EDTA(Sigma)消化传代。

1.2 蛋白表达的检测 蛋白表达测定按我们已报道的方法进行［9］。即细胞经各种处理后，用冰浴的PBS洗涤2遍，随后加入裂解缓冲液(150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris － HCl，1 g/L SDS，0.2 g/L NaN3，5 mg/L aprotinin，1.0 mmol/L PMSF，1.0 g/L NP40，5.0 g/L 脱氧胆酸钠，pH 8.0)，混匀后冰浴30 min，刮取细胞。样品经4℃、12000×g离心5 min后，取上清即蛋白提取液。蛋白定量后分别通过SDS－PAGE电泳分离蛋白和电转使蛋白转移至PVDF膜。用PBST洗脱PVDF膜5 min后，室温下封闭1 h。加入不同稀释的Ⅰ抗，室温温育2 h或4℃过夜。经PBST洗3次后加入相对应的Ⅱ抗，室温孵育2 h。PBST洗脱后经曝光、显影和定影，吸光度值(absorbance，A)通过凝胶成像系统及相应软件分析。

1.3 MTT法测定吲哚美辛对胃癌细胞活力的影响按我们已报道的方法进行［9］。将细胞(105cells/well)接种于96孔板，24 h后，依不同处理因素处理相应时间后，加入5 g/L MTT(四甲基偶氮唑盐，上海生物工程公司)10 μL/well，培养箱内继续孵育，4 h后吸去培养基，加入 DMSO(Sigma)100 μL/well，置酶标仪上(测定波长570 nm)测定A值。细胞活力(%)=(处理组A值－空白组A值)/(对照组A值－空白组A值)×100%。

1.4 吲哚美辛诱导胃癌细胞凋亡的检测 细胞凋亡检测按我们已报道的方法进行［9］。①Hoechst 33258核染色法 细胞经处理后，用多聚甲醛液(40 g/L，Sigma)固定10 min，蒸馏水洗涤后加入5 mg/L Hoechst33258(Promega)，10 min后蒸馏水洗细胞2次，自然干燥后，细胞置于荧光显微镜下(340 nm激发光)观察并拍照。②流式细胞仪检测 细胞(1×109/L)用PBS洗2次，以70%乙醇(4℃)固定过夜。离心弃乙醇，细胞重悬于含有50 mg/L碘化丙啶和50 mg/L RNase A的染色液中避光染色30 min。以流式细胞仪测定，每样品计数12000个细胞，记录荧光强度值并以相应软件处理结果，计算凋亡率。

2 统计学处理

结 果

1 吲哚美辛对胃癌细胞株MGC－803活力的影响

MTT检测结果显示100－600 μmol/L吲哚美辛处理MGC－803细胞12、24和48 h后，细胞的活力随剂量增加和时间延长而降低，见图1。

Figure 1.Effects of indomethacin on viability of MGC－803 cells.MGC －803 cells were treated with indomethacin(100 －600 μmol/L)or DMSO vehicle(0.1%)for 12，24 and 48 h.The cell viability showed a concentration－and time－dependent reduction..n=6.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs DMSO.图1 吲哚美辛对MGC－803细胞活力的影响

2 吲哚美辛诱导MGC－803细胞的凋亡

Hoechst 33258核染色法结果表明，未加吲哚美辛的MGC－803细胞，胞核较大，浅染，呈弥散均匀荧光;500 μmol/L吲哚美辛处理12 h后胞核形态变得不规则，呈条纹状或裂隙状，并见部分细胞的染色质浓缩;处理24 h后染色质进一步凝集;处理48 h后，可见染色质裂解呈块状，见图2。

流式细胞术检测发现500 μmol/L吲哚美辛处理后各组均出现明显的凋亡峰。对照组细胞凋亡百分率为(3.9±1.6)%，吲哚美辛处理12、24和48 h组细胞凋亡率分别为(19.6±3.5)%、(38.8±6.1)%和(56.6±9.7)%，P ＜0.01，见图3。

Figure 2.Morphological changes of MGC －803 cells induced by indomethacin(×400).After treated with 500 μmol/L indomethacin for 12，24 and 48 h，apoptotic bodies could be observed under fluorescent microscope.图2 吲哚美辛作用后MGC－803细胞形态学的变化

Figure 3.MGC －803 cell apoptosis after treatment with indomethacin(500 μmol/L)for 12，24 and 48 h analyzed by flow cytometry.图3 流式细胞术检测吲哚美辛处理后MGC－803细胞的凋亡率

3 吲哚美辛诱导caspase－3的活化

500 μmol/L吲哚美辛处理细胞12、24和48 h后，caspase－3酶原被激活，蛋白免疫印迹显示17 kD的活化caspase－3片段，其作用存在时间依赖性，见图4A。广谱caspase抑制剂zVAD－fmk 100 μmol/L可明显抑制吲哚美辛引起的caspase－3酶原的活化，见图4B。而且zVAD－fmk 100 μmol/L预处理后可显著降低吲哚美辛诱导的细胞凋亡作用，见图4C。这提示吲哚美辛主要通过caspase通路诱导胃癌细胞的凋亡。

Figure 4.Effects of z－VAD－fmk on indomethacin－induced apoptosis.MGC －803 cells were treated with 500 μmol/L indomethacin for 6，12 and 24 h(A)or 24 h in the presence or absence of 100 μmol/L z－VAD－fmk(z－VAD －fmk was added to the cells 2 h prior to indomethacin treatment;DMSO vehicle concentration:0.1%)(B).Proteins were extracted and used for the detection of caspase－3 cleavage by Western blotting.C:indomethacin－induced reduction of cell viability was partially prevented by pretreatment with z－VAD－fmk.Indo:indomethacin..n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs indomethacin group.图4 广谱caspase抑制剂z－VAD－fmk对吲哚美辛诱导MGC－803细胞凋亡的作用

4 吲哚美辛对Akt和GSK3β磷酸化的影响

吲哚美辛(500 μmol/L)作用于MGC－803细胞后，总Akt蛋白表达无明显变化，而Ser473位点磷酸化Akt的表达水平明显降低，见图5A、C。

吲哚美辛作用后，细胞总GSK3β的表达无显著变化，而GSK3β Ser9磷酸化水平降低，见图5B、D。

Figure 5.Effects of indomethacin on the phosphorylation of Akt and GSK3β in MGC －803 cells.Indomethacin(500 μmol/L)treatment inhibited the phosphorylation of Akt(Ser473)(A，C)and GSK3β (Ser9)(B，D)in MGC －803 cells，but did not change the total Akt and GSK3β.Indo:indomethacin..n=4.＊＊P＜0.01 vs corresponding control.图5 吲哚美辛对MGC－803细胞Akt和GSK3β磷酸化的影响

5 吲哚美辛通过PI3K/Akt/GSK3β信号通路诱导NAG－1的表达

吲哚美辛可以增加NAG－1的表达，而单独应用PI3K抑制剂 LY294002(20 μmol/L)和 Akt抑制剂1L－6－hydroxymethyl－chiro－inositol 2(R)－2－O －octadecylcarbonate(10 μmol/L)处理后，也可增加NAG－1蛋白表达。预先加入 GSK3β抑制剂SB216763(10 μmol/L)孵育1 h可完全取消PI3K抑制剂和Akt抑制剂诱导NAG－1表达的作用，见图6A、C。PI3K 抑制剂 LY294002(20 μmol/L)和 Akt抑制剂(10 μmol/L)预孵育 1 h 后再加入500 μmol/L吲哚美辛，NAG－1的表达水平与单用吲哚美辛相比无显著差异。而预先加入 GSK3β抑制剂SB216763(10 μmol/L)孵育1 h，则完全取消吲哚美辛诱导NAG－1表达的作用，见图6B、D。

6 GSK3β抑制剂对吲哚美辛诱导胃癌细胞凋亡的影响

预先加入SB216763(10 μmol/L)孵育1 h可显著抑制吲哚美辛诱导细胞凋亡的作用，见图7。

Figure 6.Effects of PI3K，Akt and GSK3β inhibitors on NAG －1 expression induced by indomethacin in MGC －803 cells.MGC －803 cells were treated with 20 μmol/L LY294002，a specific PI3K inhibitor，or 10 μmol/L 1L －6 － hydroxymethyl－ chiro － inositol 2(R)－2－O －octadecylcarbonate，a selective Akt inhibitor，or pre－addition of 10 μmol/L SB216763，a selective GSK3β inhibitor for 12 h in the presence(B，D)or absence(A，C)of 500 μmol/L indomethacin.The cell lysates were harvested for Western blotting analysis using anti－NAG－1 antibody..n=5.＊＊P＜0.01 vs control.图6 PI3K、Akt和GSK3β抑制剂对吲哚美辛诱导MGC－803细胞NAG－1表达的影响

Figure 7.GSK3β inhibitor blocks the indomethacin－induced inhibition of cells growth.Indomethacin－induced reduction of cell viability was prevented by pretreatment with 10 μmol/L SB216763(SB216763 was added to the cells 1 h prior to indomethacin treatment;DMSO vehicle concentration:0.1%).Indo:indomethacin..n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs indomethacin group.图7 GSK3β抑制剂可阻断吲哚美辛诱导的细胞凋亡作用

讨 论

Akt(PKB)是细胞存活和凋亡的重要调节因子，Akt的磷酸化可保护多种类型细胞的凋亡。越来越多的证据显示Akt可通过促进细胞的增殖和抑制细胞凋亡参与肿瘤的发生和发展［12］。在肺癌和肝癌细胞，研究表明Akt的磷酸化参与了COX－2介导的促细胞存活过程［12，13］。Akt的磷酸化位点包括催化结构域的Thr308位点和调节结构域的Ser473位点。Thr308位点的磷酸化只能部分激活Akt，只有2个位点的磷酸化才能使Akt充分活化。已有研究表明，NSAIDs诱导前列腺癌、肝细胞肝癌等的凋亡作用与抑制Akt Thr308和Ser473位点的磷酸化水平相关［14，15］。在人结肠癌细胞株 HT －29 细胞，celecoxib诱导细胞凋亡作用同时Akt和GSK3β磷酸化水平均被明显抑制［16］。活化后的Akt主要通过对含有丝氨酸/苏氨酸残基的底物磷酸化而发挥作用。GSK3β是Akt的重要底物之一，它作为细胞凋亡的上游调节因子，参与调控多种细胞的凋亡过程［17］。在基础状态下，GSK3β即有较高的活性。Akt通过磷酸化GSK3β的Ser9而抑制其活性。最近有报道认为celecoxib可通过抑制PI3K/Akt/GSK3β通路诱导结肠癌细胞的凋亡［18］。本实验中，我们在MGC－803细胞检测到基础状态Akt Ser473位点和GSK3β Ser9位点的磷酸化，吲哚美辛可明显抑制 Akt Ser473和GSK3β Ser9的磷酸化水平，而对总的 Akt和总GSK3β表达水平无影响。进一步研究发现，GSK3β选择性抑制剂 SB216763可几乎完全逆转吲哚美辛诱导MGC－803细胞凋亡的作用。这些结果说明吲哚美辛是通过Akt/GSK3β信号通路诱导MGC－803细胞凋亡。但GSK3β的信号下游底物尚未明了。

NAG－1又称为巨噬细胞抑制因子1(macrophage inhibitory factor 1，MIF－1)、生长分化因子15(growth differentiation factor 15，GDF－15)等，属于转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF－β)超家族成员。已有的研究表明，NAG－1过表达可抑制乳腺癌细胞、上皮肿瘤细胞和前列腺癌细胞的增殖［18，19］，而且 NAG －1 过表达的人结肠癌和胶质瘤细胞种植于裸鼠后，其成瘤能力明显降低［20，21］。进一步研究显示，NAG－1过表达可引起前列腺癌细胞产生 caspase依赖性的凋亡［22］。这些结果提示NAG－1与肿瘤的发生密切相关。但NAG－1的调控机制尚未完全清楚。已知NSAIDs可诱导NAG－1蛋白表达的上调。已有研究认为NSAIDs主要是通过早期生长反应基因－1(early growth response gene－1，EGR －1)上调 NAG －1的表达［23］。最近有研究提示 NAG －1的表达受 PI3K/Akt/GSK3β［24］信号通路调控。我们的实验发现，在MGC－803细胞，吲哚美辛可诱导NAG－1的表达上调。单用PI3K抑制剂和Akt抑制剂亦可明显上调NAG－1的表达，预先加入GSK3β抑制剂则完全取消PI3K抑制剂和Akt抑制剂对 NAG－1的作用，提示 PI3K/Akt/GSK3β信号通路参与调控MGC－803细胞NAG－1的表达。我们的结果与结肠癌细胞上的研究结果相一致［23］。如预先加入GSK3β抑制剂则可取消吲哚美辛上调NAG－1表达的作用，而在PI3K抑制剂和Akt抑制剂作用的基础上，吲哚美辛对NAG－1表达的上调作用与单用吲哚美辛相比并无差异。提示在胃癌细胞株MGC－803细胞，吲哚美辛主要是通过Akt/GSK3β信号通路上调NAG－1的表达。

综上所述，我们的结果表明，在胃癌细胞株MGC－803细胞，非选择性COX抑制剂吲哚美辛主要是通过Akt/GSK3β信号通路上调NAG－1的表达，进而诱导细胞的凋亡。

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