以蛋白质磷酸酶CDC25A/B为靶标的抗癌药筛选体系的构建

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(1北京大学基础医学院，北京 100191;2北京大学生命科学学院)

CDC25磷酸酶能够使蛋白质底物上磷酸化的丝/苏氨酸残基或酪氨酸残基去磷酸化，参与细胞周期调节并调控细胞应对DNA损伤［1］。近年来研究显示，CDC25A/B同时在乳腺癌、结肠癌、肺癌等［2］多种高发的人类肿瘤中高表达，CDC25A还在肝细胞癌［3］高表达，CDC25B 在前列腺癌［4］高表达，因此认为它们可能参与了人类肿瘤的发生和演进。目前，筛选以蛋白质磷酸酶CDC25A/B为靶标的新型小分子抗肿瘤药物，已成为当今肿瘤药物研发的热点［2，5］。2008年10月～2010年 10月进行本研究，通过克隆和表达人CDC25A/B融合蛋白，探讨构建高通量靶向抗癌药筛选体系的途径。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒 pGEX-4T-1载体、大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)由本实验室保存。

1.2 主要试剂 Taq DNA聚合酶、限制性内切酶BamH I和Xho I、T4 DNA连接酶购自Takara公司;DNA片段快速回收试剂盒、谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B购自北京鼎国公司;DNA序列分析由北京三博远志公司完成;还原型谷胱甘肽(GSH)购自北京欣经科生物技术公司;对硝基苯基磷酸盐(pNPP)购自Amresco公司;维生素K3(VK3)购自Johnson Matthey公司。

1.3 引物设计 根据 GenBank数据，针对人CDC25A(283～523 aa)催化结构域序列和CDC25B(275～566 aa)催化结构域序列分别设计两对引物，经巢式PCR扩增出目的基因。第1轮 PCR:CDC25A引物:上游:5'-GTTTGACTCCCCTTCCCTGTGTAG-3'，下 游:5'-TTGGGCTGCTGCTGGCTGGTCCTG-3';CDC25B引物:上游:5'-GGGCCAGCCGCAGGGAAG-3'，下 游:5'-TGGGGCAGACAGGCAGGACACC-3'。第2轮PCR:CDC25A引物:上游:5'-CGGGATCCTCTCCACCTGGAAGTACAAAG-3'，下游:5'-CCGCTCGAGGAGCTTCTTCAGACGACTGAT-3';CDC25B引物:上游:5'-CGGGATCCCAGCGGCTCTTCCGCTCTCCG-3'，下 游:5'-CCGCTCGAGCTGGTCCTGCAGCCGGCTACA-3'。在第2轮PCR上游引物的5'端和下游引物的5'端分别引入BamH I和Xho I限制性酶切位点。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR扩增人 CDC25A/B基因 以本实验室保存的人HEK293细胞cDNA为模板，加入合成的上下游引物经RT-PCR扩增出CDC25A。以本实验室保存的HeLa细胞cDNA为模板，加入合成的上下游引物经RT-PCR扩增出CDC25B。用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果，并切胶回收，同时对DNA定量。

1.2.2 pGEX-4T-1-CDC25A/B 重组质粒的构建将携带有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签的pGEX-4T-1载体及纯化的CDC25A和CDC25B PCR产物分别用BamH I和Xho I进行双酶切，T4 DNA连接酶于4℃连接过夜，将连接产物 pGEX-4T-1-CDC25A/B重组质粒分别转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，以氨苄青霉素抗性初筛，挑取单克隆提取质粒，进行BamH I和Xho I双酶切鉴定。

1.2.3 重组GST-CDC25A/B融合蛋白的诱导表达将测序正确的 pGEX-4T-1-CDC25A质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，从37℃培养过夜的LB平板上挑取菌落，接种于LB液体培养基5 ml中，37℃振荡培养过夜;次日按1∶250的比例接种于1 L新鲜培养基中，37℃振荡培养至OD600值达到0.5～0.6时，取出少量以备分析;加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L，25℃继续振荡培养6 h，同样取出少量以备分析;离心收集菌体。GST-CDC25B的诱导表达过程同上。

1.2.4 重组GST-CDC25A/B融合蛋白的纯化 在每升LB培养基收集的菌体中加入30 ml裂解液，冰上裂解30 min后4℃、17 300 g离心15 min，收集上清;将上清缓慢通过预先用PBS平衡的Glutathione Sepharose 4B，用流洗液洗柱，洗脱目的蛋白，经12%SDS-PAGE检测融合蛋白，合并目的蛋白洗脱峰，加5%甘油－80℃冰箱保存。GST-CDC25B的纯化过程同上。

1.2.5 重组GST-CDC25A/B融合蛋白的活性测定以pNPP作为底物，于96孔板中每孔加入磷酸酶活性测定缓冲液和梯度剂量的纯化后的GSTCDC25A融合蛋白共135 μl，再加入100 mmol/L p-NPP 15 μl/孔。于37℃温箱孵育2 h后，每孔加入4 mol/L NaOH 12.5 μl终止反应。用酶标仪测量波长405 nm的吸光度(A)值。以仅加入活性测定缓冲液和pNPP的空白孔调零。GST-CDC25B活性测定过程同上。

1.2.6 以CDC25A/B为靶标的磷酸酶抑制剂验证性筛选 根据上述测定融合蛋白活性的方法，于96孔板中加入磷酸酶活性测定缓冲液、GST-CDC25A融合蛋白(3.5 μg/孔)和一系列浓度梯度稀释的VK3共135 μl，先于4 ℃孵育30 min，再向每孔加入100 mmol/L pNPP 15 μl，37 ℃温箱孵育2 h 后，每孔加入4 mmol/L NaOH 12.5 μl终止反应。用酶标仪测量波长405 nm的A值。VK3对GST-CDC25B的活性抑制实验步骤同上(用量为1 μg/孔)。

2 结果

2.1 RT-PCR产物及重组质粒的鉴定 见图1。

2.2 重组GST-CDC25A/B融合蛋白的表达及纯化见图2。

图1 CDC25A/B基因PCR产物及pGEX-4T-1-CDC25A/B重组质粒的双酶切鉴定结果

图2 SDS-PAGE分析GST-CDC25A/B融合蛋白的表达及纯化结果

2.3 重组GST-CDC25A/B融合蛋白活性测定结果底物水解活性与融合蛋白之间存在剂量依赖性(GST-CDC25A/B融合蛋白与底物水解活性间的线性相关系数r均＞0.99)，且GST-CDC25B融合蛋白的活性高于GST-CDC25A，前者约是后者的6倍，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.4 验证性抑制剂筛选显示VK3对CDC25A/B的作用 以pNPP为底物，测得VK3对重组GSTCDC25A/B融合蛋白活性均具有剂量依赖性抑制作用。VK3对CDC25A/B的半数抑制浓度(IC50)分别为 0.8 和 1.8 μg/ml，表明 VK3对 CDC25A 有更强的抑制作用，即对CDC25A的抑制作用是CDC25B的2.3 倍。

3 讨论

细胞周期紊乱是肿瘤细胞的标志性特征之一。最近几年有关CDC25在人类肿瘤细胞中过度表达的报道屡见不鲜，尤其是CDC25A/B亚型的表达与肿瘤发生密切相关。通常高表达CDC25A/B亚型的肿瘤恶性程度较高且患者预后较差，术后5年生存率较低。肿瘤组织中高表达的CDC25磷酸酶可使底物CDK2或CDK1分子上抑制性磷酸化位点(Thr14和Tyr15)去磷酸化，促进肿瘤细胞周期G1/S和G2/M期的行进，促进肿瘤细胞生长。因此，研制针对CDC25A/B磷酸酶的高选择性靶向抗癌药物，有可能抑制CDC25A/B的上述作用，使细胞周期阻断，甚至诱导肿瘤细胞发生凋亡，对于高表达CDC25磷酸酶肿瘤的治疗及完善肿瘤综合治疗方案具有重要价值［6］。

虽然20世纪末人们已报道了CDC25A/B磷酸酶催化结构域的晶体结构，但磷酸酶与其小分子抑制物相互作用的规律尚未被人们完全认识［7］，使得CDC25磷酸酶靶向抗癌药的研制长期以来进展缓慢。迄今为数不多的高效选择性CDC25磷酸酶抑制剂都是以pNPP、3-奥美拉唑—荧光素—单磷酸盐(OMFP)等作为底物经体外筛选获得的［8］。本研究将CDC25A/B催化区结构域cDNA序列克隆到携带GST标签的pGEX-4T-1中，通过IPTG诱导，分别表达了GST-CDC25A/B融合蛋白，并在96孔板中以pNPP为底物测定了纯化后融合蛋白的活性，发现融合蛋白GST-CDC25A/B在微克级别均展示出良好的底物水解活性，表明融合蛋白对于底物pNPP具有较高的灵敏度。以pNPP为底物可利用常规酶标仪进行高通量检测，具有简便易行的优点。

VK3作为CDC25磷酸酶的小分子抑制剂展示出广谱的抗肿瘤活性。Wu等［9］的研究显示，VK3能够与CDC25A的催化结构域共价结合并抑制其磷酸酶活性，阻止底物CDK1上磷酸化的Thr14和Tyr15水解，诱导细胞周期阻滞并导致细胞凋亡。然而，VK3对 CDC25B是否也有抑制作用、与CDC25A相比VK3对何种CDC25的抑制作用更强等问题，目前尚未见文献报道。本文研究证实，VK3能够抑制CDC25A/B的磷酸酶活性，并发现在相同实验条件下VK3对CDC25B的抑制作用较弱，其IC50值是 CDC25A的2.3倍。该发现为深入探讨VK3对癌细胞周期阻断的分子机制提供了线索。

综上所述，本研究表达和纯化了具有磷酸酶活性的GST-CDC25A/B融合蛋白，并以pNPP为底物建立了基于96孔板的靶酶抑制剂高通量筛选体系。目前，正在应用该筛选体系研发以CDC25A/B为靶标的VK3衍生物类新型靶向抗癌药。

［1］Boutros R，Lobjois V，Ducommun B.CDC25 phosphatases in cancer cells:key players?Good targets［J］.Nat Rev Cancer，2007，7(7):495-507.

［2］Kristjánsdóttir K，Rudolph J.Cdc25 phosphatases and cancer［J］.Chem Biol，2004，11(8):1043-1051.

［3］Xu X，Yamamoto H，Sakon M，et al.Overexpression of CDC25A phosphatase is associated with hypergrowth activity and poor prognosis of human hepatocellular carcinomas ［J］.Clin Cancer Res，2003，9(5):1764-1772.

［4］Ngan E，Hashimoto Y，Ma ZQ，et al.Overexpression of Cdc25B，an androgen receptor coactivator，in prostate cancer［J］.Oncogene，2003，22(5):734-739.

［5］成静，付强，伍刚.CDC25B与恶性肿瘤研究进展［J］.中华肿瘤防治，2007，14(11):872-875.

［6］梁荣祥，李苏萌.恶性肿瘤的分子靶向治疗［J］.山东医药，2010，50(1):104-105.

［7］Slack DN，Seternes OM，Gabrielsen M，et al.Distinct binding determinants for ERK2/p38 and JNK map kinases mediate catalytic activation and substrate selectivity of MAP kinase phosphatase-1 ［J］.J Biol Chem，2001，276(19):16491-16500.

［8］Eckstein J.Cdc25 as a potential target of anticancer agents［J］.Invest New Drugs，2000，18(2):149-156.

［9］Wu FY，Sun TP.Vitamin K3 induces cell cycle arrest and cell death by inhibiting Cdc25 phosphatase［J］.Eur J Cancer，1999，35(9):1388-1393.